A.中草藥有效成分的提取



B.分离和純化



C.層析法










  A.中草藥有效成分的提取:



  (一)溶劑提取法:



   1.溶劑提取法的原理:溶劑提取法是根据中草藥中各种成分在溶劑中的溶解性質,選用對活性成分溶解度大,對不需要溶出成分溶解度小的溶劑,而將有效成分
從藥材組織內溶解出來的方法。當溶劑加到中草藥原料(需适當粉碎)中時,溶劑由于擴散、滲透作用逐漸通過細胞壁透入到細胞內,溶解了可溶性物質,而造成細 胞內外的濃度差,于是細胞內的濃溶液不斷向外擴散,溶劑又不斷進入藥材組織細胞中,如此多次往返,直至細胞內外溶液濃度達到動態平衡時,將此飽和溶液濾
出,繼續多次加入新溶劑,就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。



  中草藥成分在溶劑中的溶解度直接与溶劑性質有關。溶劑可分為水、親本性有机溶劑及親脂性有机溶劑,被溶解物質也有親水性及親脂性的不同。



   有机化合物分子結构中親水性基團多,其极性大而疏于油;有的親水性基團少,其。极性小而疏于水。這种親水性、親脂性及其程度的大小,是和化合物的分子結
构直接相關。一般來說,兩种基本母核相同的成分,其分子中功能基的极性越大,或极性功能基數量越多,則整個分子的极性大,親水性強,而親脂性就越弱,其分 子非极性部分越大,或碳鍵越長,則极性小,親脂性強,而親水性就越弱。



  各類溶劑的性質,同樣也与其分子結构有關。例如甲醇、乙醇是親水性比較強的溶劑,它們的分子比較小,有羥基存在,与水的結构很近似,所以能夠和水任意
混合。丁醇和戊醇分子中雖都有羥基,保持和水有相似處,但分子逐漸地加大,与水性質也就逐漸疏遠。所以它們能彼此部分互溶,在它們互溶達到飽和狀態之后, 丁醇或戊醇都能与水分層。氯仿、苯和石油醚是烴類或氯烴衍生物,分子中沒有氧,屬于親脂性強的溶劑。



   這樣,我們就可以通過時中草藥成分結构分析,去估計它們的此類性質和選用的溶劑。例如葡萄糖、蔗糖等分子比較小的多羥基化合物,具有強親水性,极易溶于
水,就是在親水性比較強的乙醇中也難于溶解。淀粉雖然羥基數目多,但分子大大,所以難溶解于水。蛋白質和氨基酸都是酸鹼兩性化合物,有一定程度的极性,所 以能溶于水,不溶于或難溶子有机溶劑。 類都比其 元的親水性強,特別是皂 由于它們的分子中往往結合有多數糖分子,羥基數目多,能表現出較強的親水性,
而皂 元則屬于親脂性強的化合物。多數游离的生物鹼是親脂性化合物,与酸結合成鹽后,能夠离子化,加強了极性,就變為親水的注質,這些生物鹼可稱為半极性
化合物。所以,生物鹼的鹽類易溶于水,不溶或難溶于有机溶劑;而多數游离的生物鹼不溶或難溶于水,易溶于親脂性溶劑,一般以在氯仿中溶解度最大。
鞣質是多
羥基的化台物,為親水性的物質。油脂、揮發油、蜡、脂溶性色素都是強親脂性的成分。



  總的說來,只要中草藥成分的親水性和親脂性与溶劑的此項性質相當,就會在其中有較大的溶解度,即所謂“相似相溶”的規律。這是選擇适當溶劑自中草藥中提取所需要成分的依据之一。



  2.溶劑的選擇:運用溶劑提取法的關鍵,是選擇适當的溶劑。溶劑選擇适當,就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點:溶劑對有效成分溶解度大,對雜質溶解度小;溶劑不能与中藥的成分起化學變化;溶劑要經濟、易得、使用安全等。



常見的提取溶劑可分為以下三類:



  1) 水:水是一种強的极性溶劑。中草藥中親水性的成分,如無机鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質、氨基酸、蛋白質、有机酸鹽、生物鹼鹽及 類等都能被水溶
出。為了增加某些成分的溶解度,也常采用酸水及鹼水作為提取溶劑。酸水提取,可使生物鹼与酸生成鹽類而溶出,鹼水提取可使有机酸、黃酮、恩昆、內酯、香豆 素以及酚類成分溶出。但用水提取易 解 類成分,且易霉坏變質。某些含果膠、粘液質類成分的中草藥,其水提取液常常很難過濾。沸水提取時,中草藥中的淀粉
可被糊化,而增加過濾的困難。故含淀粉量多的中草藥,不宜磨成細粉后加水煎煮。中藥傳統用的湯劑,多用中藥飲片直火煎煮,加溫可以增大中藥成分的溶解度 外,還可能有与其他成分產生“助溶”現象,增加了一些水中溶解度小的、親脂性強的成分的溶解度。但多數親脂性成分在沸水中的溶解度是不大的,既使有助溶現
象存在,也不容易提取完全。如果應用大量水煎煮,就會增加蒸發濃縮時的困難,且會溶出大量雜質,給進一步分离提純帶來麻煩。中草藥水提取液中含有皂 及粘 液質類成分,在減壓濃縮時,還會產生大量泡沫,造成濃縮的困難。通常可在蒸餾器上裝置一個汽一液分离防濺球加以克服,工業上則常用薄膜濃縮裝置。



  2) 親水性的有机溶劑:也就是一般所說的与水能混溶的有机溶劑,如乙醇(酒精)、甲醇(木精)、丙酮等,以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好,對中草藥細胞的
穿透能力較強。親水性的成分除蛋白質、粘液質、果膠、淀粉和部分多糖等外,大多能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分,在乙醇中的溶解度也較大。還可以根 据被提取物質的性質,采用不同濃度的乙醇進行提取。用乙醇提取比用水量較少,提取時間短,溶解出的水溶性雜質也少。乙醇為有机溶劑,雖易燃,但毒性小,价
格便宜,來源方便,有一定設備即可回收反复使用,而且乙醇的提取液不易發霉變質。由于這些原因,用乙醇提取的方法是歷來最常用的方法之一。甲醇的性質和乙 醇相似,沸點較低(64℃),但有毒性,使用時應注意。



  3) 親脂性的有机溶劑:也就是一般所說的与水不能混溶的有机溶劑,如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。這些溶劑的選擇性能強,不能或不容易提出
親水性雜質。但這類溶劑揮發性大,多易燃(氯仿除外),一般有毒,价格較貴,設備要求較高,且它們透入植物組織的能力較弱,往往需要長時間反复提取才能提 取完全。如果藥材中含有較多的水分,用這類溶劑就很難浸出其有效成分,因此,大量提取中草藥原料時,直接應用這類溶劑有一定的局限性。



  3.提取方法:用溶劑提取中草藥成分,、常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續回流提取法等。同時,原料的粉碎度、提取時間、提取溫度、設備條件等因素也都能影響提取效率,必須加以考慮。



  1)浸漬法:浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝人适當的容器中,加入适宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水),浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡單易行,但浸出率較差,且如用水為溶劑,其提取液易于發霉變質)須注意加入适當的防腐劑。



  2) 滲漉法:滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中,不斷添加新溶劑,使其滲透過藥材,自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一种浸出方法小當溶劑滲進藥粉溶出成分比
重加大而向下移動時,上層的溶液或稀浸液便置換其位置,造成良好的濃度差,使擴散能較好地進行,故浸出效果优于浸漬法。但應控制流速,在滲渡過程中隨時自 藥面上補充新溶劑,使藥材中有效成分充分浸出為止。或當滲滴液顏色极淺或滲涌液的體積相當于:原藥材重的10倍時,便可認為基本上已提取完全。在大量生產
中常將收集的稀滲淮液作為另一批新原料的溶劑之用。



  3) 煎煮法:煎煮法是我國最早使用的傳統的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿,不宜用鐵鍋,以免藥液變色。直火加熱時最好時常攪拌,以免局
部藥材受熱太高,容易焦糊。有蒸汽加熱設備的藥厂,多采用大反應鍋、大銅鍋、大木桶,或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數個煎煮器通過管道互相連接, 進行連續煎浸。



  4) 回流提取法:應用有机溶劑加熱提取,需采用回流加熱裝置,以免溶劑揮發損失。小量操作時,可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶內裝藥材約為容量的%~%,溶
劑浸過藥材表面約1~2cm。在水浴中加熱回流,一般保持沸騰約:小時小放冷過濾,再在藥渣中加溶劑,作第二、三次加熱回流分別約半小時,或至基本提盡有 效成分為止。此法提取效率較冷浸法高,大量生產中多采用連續提取法。



  5) 動連續提取法:應用揮發性有机溶劑提取中草藥有效成分,不論小型實驗或大型生產,均以連續提取法為好,而且需用溶劑量較少,提取成分也較完全。實驗室常用
脂肪提取器或稱索氏提取器。連續提取法,一般需數小時才能提取完全。提取成分受熱時間較長,遇熱不穩定易變化的成分不宜采用此法。



  (二)水蒸气蒸餾法:。水蒸气蒸餾法,适用于能隨水蒸气蒸餾而不被破坏的中草藥成分的提取。此類成分的沸點多在100℃ 以上,与水不相混溶或僅微溶,且在約100℃時存一定的蒸气壓。當与水在一起加熱時,其蒸气壓和水的蒸气壓總和為一個大气壓時,液體就開始沸騰,水蒸气將
揮發性物質一并帶出。例如中草藥中的揮發油,某些小分子生物鹼一麻黃鹼、蕭鹼、檳榔鹼,以及某些小分子的酚性物質。牡丹酚(paeonol)等,都可應用 本法提取。有些揮發性成分在水中的溶解度稍大些,常將蒸餾液重新蒸餾,在最先蒸餾出的部分,分出揮發油層,或在蒸餾液水層經鹽析法并用低沸點溶劑將成分提
取出來。例如玫瑰油、原白頭翁素(protoanemonin)等的制備多采用此法。



  (三)升華法:固體物質受熱直接气化,遇冷后又凝固為固體化合物,稱為升華。中草藥中有一些成分具有升華的性質,故可利用升華法直接自中草藥中提取出來。例如樟木中升華的樟腦(camphor),在《本草綱目》中已有詳細的記載,為世界上最早應用升華法制取藥材有效成分的記述。茶葉中的咖啡鹼在178℃以上就能升華而不被分解。游离羥基恩昆類成分,一些香豆素類,有机酸類成分,有些也具有升華的性質。例如七葉內酯及苯甲酸等。



  升華法雖然簡單易行,但中草藥炭化后,往往產生揮發性的焦油狀物,粘附在升華物上,不易精制除去,其次,升華不完全,產率低,有時還伴隨有分解現象。  



  B.分离和純化:



  上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物,需進一步除去雜質,分离并進行精制。具體的方法隨各中草藥的性質不同而异,以后將通過實例加以敘述,此處只作一般原則性的討論。



   (一)溶劑分离法:一般是將上述總提取物,選用三、四种不同极性的溶劑,由低极性到高极性分步進行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常常為膠伏物,難以均勻分
散在低极性溶劑中,故不能提取完全,可拌人适量惰性填充劑,如硅藻土或纖維粉等,然后低溫或自然干燥,粉碎后,再以選用溶劑依次提取,使總提取物中各組成 成分,依其在不同极性溶劑中溶解度的差异而得到分离。例如粉防己乙醇浸膏,鹼化后可利用乙醚溶出脂溶性生物鹼,再以冷苯處理溶出粉防己鹼,与其結构類似的
防己諾林鹼比前者少一甲基而有一酚羥基,不溶于冷苯而得以分离。利用中草藥化學成分,在不同极性溶劑中的溶解度進行分离純化,是最常用的方法。



   廣而言之,自中草藥提取溶液中加入另一种溶劑,析出其中某种或某些成分,或析出其雜質,也是一种溶劑分离的方法。中草藥的水提液中常含有樹膠、粘液質、
蛋白質、糊化淀粉等,可以加入一定量的乙醇,使這些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出,而達到与其它成分分离的目的。例如自中草藥提取液中除去這些雜質, 或自白及水提取液中獲得白及膠,可采用加乙醇沉淀法;自新鮮括樓根汁中制取天花粉素,可滴人丙酮使分次沉淀析出。目前,提取多糖及多 類化合物,多采用水
溶解、濃縮、加乙醇或丙酮析出的辦法。



  此外,也可利用其某些成分能在酸或鹼中溶解,又在加鹼或加酸變更溶液的pH
后,成不溶物而析出以達到分离。例如內酯類化合物不溶于水,但遇鹼開環生成羧酸鹽溶于水,再加酸酸化,又重新形成內酯環從溶液中析出,從而与其它雜質分
离;生物鹼一般不溶于水,遇酸生成生物鹼鹽而溶于水,再加鹼鹼化,又重新生成游离生物鹼。這些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶劑進行萃取分离。一般中 草藥總提取物用酸水、鹼水先后處理,可以分為三部分:溶于酸水的為鹼性成分(如生物鹼),溶于鹼水的為酸性成分(如有机酸),酸、鹼均不溶的為中性成分
(如甾醇)。還可利用不同酸、鹼度進一步分离,如酸性化台物可以分為強酸性、弱酸性和酷熱酚性三种,它們分別溶于碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉,借此可進行 分离。有些總生物鹼,如長春花生物鹼、石蒜生物鹼,可利用不同rH值進行分离。但有些特殊情況,如酚性生物鹼紫董定鹼(corydine)在氫氧化鈉溶液
中仍能為乙醚抽出,蝙蝠葛鹼(dauricins)在乙醚溶液中能為氫氧化鈉溶液抽出,而溶于氯仿溶液中則不能被氫氧化鈉溶液抽出;有些生物鹼的鹽類,如 四氫掌葉防己鹼鹽酸鹽在水溶液中仍能為氯仿抽出。這些性質均有助于各化合物的分离純化。



  (二)兩相溶劑萃取法:



   1.萃取法:兩相溶劑提取又簡稱萃取法,是利用混合物中各成分在兩种互不相溶的溶劑中分配系數的不同而達到分离的方法。萃取時如果各成分在兩相溶劑中分
配系數相差越大,則分离效率越高、如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質,一般多用親脂性有机溶劑,如苯、氯仿或乙醚進行兩相萃取,如果有效成分是偏 于親水性的物質,在親脂性溶劑中難溶解,就需要改用弱親脂性的溶劑,例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取
黃酮類成分時,多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強的皂 則多選用正丁醇、异戊醇和水作兩相萃取。不過,一般有机溶劑親水性越大,与水作兩相萃取的 效果就越不好,因為能使較多的親水性雜質伴隨而出,對有效成分進一步精制影響很大。



  兩相溶劑萃取在操作中還要注意以下几點:



  1) 先用小試管猛烈振搖約1分鐘,觀察萃取后二液層分層現象。如果容易產生乳化,大量提取時要避免猛烈振搖,可延長萃取時間。如碰到乳化現象,可將乳化層分
出,再用新溶劑萃取;或將乳化層抽濾,或將乳化層稍稍加熱;或較長時間放置并不時旋轉,令其自然分層。乳化現象較嚴重時,可以采用二相溶劑逆流連續萃取裝 置。



  2) 水提取液的濃度最好在比重1.1~1.2之間,過稀則溶劑用量太大,影響操作。



  3) 溶劑与水溶液應保持一定量的比例,第一次提取時,溶劑要多一些,一般為水提取液的1/3,以后的用量可以少一些,一般1/4-1/6。



  4)一般萃取3~4次即可。但親水性較大的成分不易轉入有机溶劑層時,須增加萃取次數,或改變萃取溶劑。



   萃取法所用設備,如為小量萃取,可在分液漏斗中進行;如系中量萃取,可在較大的适當的下口瓶中進行。在工業生產中大量萃取,多在密閉萃取罐內進行,用攪
拌机攪拌一定時間,使二液充分混合,再放置令其分層;有時將兩相溶液噴霧混含,以增大萃取接触,提高萃取效率,也可采用二相溶劑逆流連續萃取裝置。



   2.逆流連續萃取法:是一种連續的兩相溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數根或更多的萃取管。管內用小瓷圈或小的不鏽鋼絲圈填充,以增加兩相溶劑萃取時的
接触面。例如用氯仿從川楝樹皮的水浸液中萃取川楝素。將氯仿盛于萃取管內,而比重小于氯仿的水提取濃縮液貯于高位容器內,開啟活塞,則水浸液在高位壓力下 流入萃取管,遇瓷圈撞擊而分散成細粒,使与氯仿接触面增大,萃取就比較完全。如果一种中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進行萃取,則需將水提濃
縮液裝在萃取管內,而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內。萃取是否完全,可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應或沉淀反應進行檢查。



   3.逆流分配法(CounterCurrentDistribution,CCD):逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与
兩相溶劑逆流萃取法原理一致,但加樣量一定,并不斷在一定容量的兩相溶劑中,經多次移位萃取分配而達到混合物的分离。本法所采用的逆流分布儀是由若干乃至 數百只管子組成。若無此儀器,小量萃取時可用分液漏斗代替。預先選擇對混合物分离效果較好,即分配系數差异大的兩种不相混溶的溶劑。并參考分配層析的行為
分析推斷和選用溶劑系統,通過試驗測知要經多少次的萃取移位而達到真正的分离。逆流分配法對于分离具有非常相似性質的混合物,往往可以取得良好的效果。但 操作時間長,萃取管易因机械振蕩而損坏,消耗溶劑亦多,應用上常受到一定限制。



   4.液滴逆流分配法:液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來在逆流分配法基礎上改進的兩相溶劑萃取法。。對溶劑系統的選擇基本同逆流分配法,但要
求能在短時間內分离成兩相,并可生成有效的液滴。由于移動相形成液滴,在細的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不斷形成新的表面,促進溶質在兩相溶劑 中的分配,故其分离效果往往比逆流分配法好。且不會產生乳化現象,用氮气壓驅動移動相,被分离物質不會因遇大气中氧气而氧化。本法必須選用能生成液滴的溶
劑系統,且對高分子化合物的分离效果較差,處理樣品量小(1克以下),并要有一定設備。應用液滴逆流分配法曾有效地分离多种微量成分如柴胡皂 原小檗鹼型 季銨鹼等。液滴逆流分配法的裝置,近年來雖不斷在改進,但裝置和操作較繁。目前,對适用于逆流分配法進行分离的成分,可采用兩相溶劑逆流連續萃取裝置或分
配柱層析法進行。



  (三)沉淀法:是在中草藥提取液中加入某些試劑使產生沉淀,以獲得有效成分或除去雜質的方法。



   1. 鉛鹽沉淀法:鉛鹽沉淀法為分离某些中草藥成分的經典方法之一。由于醋酸鉛及鹼式醋酸鉛在水及醇溶液中,能与多种中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡鹽沉淀,故可
利用這种性質使有效成分与雜質分离。中性醋酸鉛可与酸性物質或某些酚性物質結合成不溶性鉛鹽。因此,常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白質、粘液質、鞣質、樹 脂、酸性皂 、部分黃酮等。可与鹼式醋酸鉛產生不溶性鉛鹽或絡合物的范圍更廣。通常將中草藥的水或醇提取液先加入醋酸鉛濃溶液,靜置后濾出沉淀,并將沉淀
洗液并入濾液,于濾液中加鹼式醋酸鉛飽和溶液至不發生沉淀為止,這樣就可得到醋酸鉛沉淀物、鹼式醋酸鉛沉淀物及母液三部分。



   然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中,通以硫化氫气體,使分解并轉為不溶性硫化鉛而沉淀。含鉛鹽母液亦須先如法脫鉛處理,再濃縮精制。硫化氫脫鉛比較徹底,但
溶液中可能存有多余的硫化氫,必須先通人空气或二氧化碳讓气泡帶出多余的硫化氫气體,以免在處理溶液時參与化學反應。新生態的硫化鉛多為膠體沉淀,能吸咐 藥液中的有效成分,要注意用溶劑處理收回。脫鉛方法,也可用硫酸、磷酸、硫酸鈉、磷酸鈉等除鉛,但硫酸鉛、磷酸鉛在水中仍有一定的溶解度,除鉛不徹底。用
陽离子交換樹脂脫鉛快而徹底,但要注意藥液中某些有效成分也可能被交換上去,同時脫鉛樹脂再生也較困難。還應注意脫鉛后溶液酸度增加,有時需中和后再處理 溶液,有時可用新制備的氫氧化鉛、氫氧化鋁、氫氧化銅或碳酸鉛、明礬等代替醋酸鉛、鹼式醋酸鉛。例如在黃芩水煎液中加入明礬溶液,黃芩 就与鋁鹽絡合生成
難溶于水的絡化物而与雜質分离,這种絡化物經用水洗淨就可直接供藥用。



   2. 試劑沉淀法:例如在生物鹼鹽的溶液中,加入某些生物鹼沉淀試劑(見生物鹼性質下),則生物鹼生成不溶性复鹽而析出。水溶性生物鹼難以用萃取法提取分出,常
加入雷氏銨鹽使生成生物鹼雷氏鹽沉淀析出。又如橙皮 、蘆丁、黃芩 、甘草皂 均易溶于鹼性溶液,當加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白質溶液,可以變更溶 液的pH值利用其在等電點時溶解度最小的性質而使之沉淀析出。此外,還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質;膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂 等。可根据中草藥有效
成分和雜質的性質,适當選用。



  (四) 鹽析法:鹽析法是在中草藥的水提液中、加入無机鹽至一定濃度,或達到飽和狀態,可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出,而与水溶性大的雜質分离。常用作
鹽析的無机鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。例如三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態,三七皂 乙即可沉淀析出,自黃藤中提取掌葉防己鹼,自三顆針 中提取小檗鹼在生產上都是用氯化鈉或硫酸按鹽析制備。有些成分如原白頭翁素、麻黃鹼、苦參鹼等水溶性較大,在提取時,亦往往先在水提取液中加入一定量的食
鹽,再用有机溶劑萃取。



  (五)透析法:透析法是利用 小分子物質在溶液中可通過半透膜,而大分子物質不能通過半透膜的性質,達到分离的方法。例如分离和純化皂 、蛋白質、多 、多糖等物質時,可用透析法以除
去無机鹽、單糖、雙糖等雜質。反之也可將大分子的雜質留在半透膜內,而將小分子的物質通過半透膜進入膜外溶液中,而加以分离精制:透析是否成功与透析膜的 規格關系极大。透析膜的膜孔有大有小,要根据欲分离成分的具體情況而選擇。透析膜有動物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜(硫酸紙膜)、蛋白質膠膜、玻璃紙膜等。
油常多用市售的玻璃紙或動物性半透膜扎成袋狀,外面用尼龍网袋加以保護,小心加入欲透析的樣品溶液,懸挂在清水容器中。經常更換清水使透析膜內外溶液的濃 度差加大,必要時适當加熱,并加以攪拌,以利透析速度加快。為了加快透析速度,還可應用電透析法,即在半在半透膜旁邊純溶劑兩端



  放置二個電极,接通電路,則透析膜中的帶有正電荷的成分如無机陽离子、生物鹼等向陰极移動,而帶負電共荷的成分如無机陰离子、有机酸等則向陽极移動,中性化合物及高分子化合物則留在透析膜中。透析是否完全,須取透析膜內溶液進行定性反應檢查。



  一般透析膜可以自制:動物半透膜如豬、牛的膀胱膜、用水洗淨,再以乙醚脫脂,,即可供用;羊皮紙膜可將濾紙浸入50% 的硫酸15~60分鐘,取出鋪在板上,以水沖洗制得。其膜孔大小与硫酸濃度、浸泡時間以及用水沖洗速度有關;火棉膠膜系將火棉膠溶于乙醚及無水乙醇,涂在
板上,干后放置水中即可供用,其膜孔大小与溶劑种類、溶劑揮發速度有關,溶劑中加入适量水可使膜孔增大,加入少量醋酸可使膜孔縮小;蛋白質膠(明膠)膜可 用20%明膠涂于細布上,陰干后放水中,再加甲醛使膜凝固,沖洗干淨即可供用。近來商品有透析膜管成品出售,國外習稱
“ViskingDialysisTubing”,有各种大小厚度規格,可供不同大小分子量的多糖、多 透析時選用。



   (六)結晶、重結晶和分步結晶法:鑒定中草藥化學成分,研究其化學結构,必須首先將中草藥成分制備成單體純品。在常溫下,物質本身性質是液體的化台物,
可分別用分餾法或層析法進行分离精制。一般他說,中草藥化學成分在常溫下多半是固體的物質,都具有結晶他的通性,可以根据溶解度的不同用結晶法來達到分离 精制的目的。研究中草藥化學成分時,一旦獲得結晶,就能有效地進一步精制成為單體純品。純化台物的結晶有一定的熔點和結晶學的特征,有利于鑒定。如果鑒定
的物質不是單體純品,不但不能得出正确的結論,還會造成工作上的浪費。因此,求得結晶并制備成單體純品,就成為鑒定中草藥成分、研究其分子結构重要的一 步。



  1.雜 質的除去:中草藥經過提取分离所得到的成分,大多仍然含有雜質,或者是混合成分。有時即使有少量或微量雜質存在,也能阻礙或延緩結晶的形成。所以在制備結
晶時,必須注意雜質的干扰,應力求盡可能除去。有時可選用溶劑溶出雜質,或只溶出所需要的成分。有時可用少量活性炭等進行脫色處理,以除去有色雜質。有時 可通過氧化鋁,硅膠或硅藻土短柱處理后,再進行制備結晶。但應用吸附劑除去雜質時,要注意所需要的成分也可能被吸附而損失。此外,層析法更是分离制備單體
純品所常用的有效方法。



  如果一再處理仍未能使近于純品的成分結晶化,則可先制備其晶態的衍生物,再回收原物,可望得到結晶。例如游离生物鹼可制備各种生物鹼鹽類,羥基化合物可轉變成乙酸化物,碳基化台物可制備成苯蹤衍生物結晶。美登鹼在原料中含量少,且反复分离精制難以得到結晶,但制備成3一滇丙基美登鹼結晶后,再經水解除去澳丙基,美登鹼就能制備成為結晶。



   2.溶劑的選擇;制備結晶,要注意選擇合宜的溶劑和應用适量的溶劑。合宜的溶劑,最好是在冷時對所需要的成分溶解度較小,而熱時溶解度較大。溶劑的沸點
亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶劑中不易形成結晶,而在某些溶劑中則易于形成結晶。例如葛根素、逆沒食子 酸(ellagicacid)在冰醋酸中易形成結晶,大黃素(emodin)在 啶中易于結晶,萱草毒素(hemerocallin)在N,N一二甲基甲
 胺(DMF)中易得到結晶,而穿心蓮亞硫酸氫鈉加成物在丙酮一水中較易得到結晶。又如蝙蝠葛鹼通常為無定形粉未,但能和氯仿或乙醚形成為加成物結晶。



  3.結晶溶液的制備:制備結晶的溶液,需要成為過飽和的溶液。一般是應用适量的溶劑在加溫的情況下,將化合物溶解再放置冷處。如果在室溫中可以析出結晶,就不一定放置于冰箱中,以免伴隨結晶析出更多的雜質。



  “新生態”的物質即新游离的物質或無定形的粉未狀物質,遠較晶體物質的溶解度大,易于形成過飽和溶液。一般經過精制的化合物,在蒸去溶劑抽松為無定形粉未時就是如此,有時只要加入少量溶劑,往往立即可以溶解,稍稍放置即能析出結晶。例如長春花總弱鹼部分抽松后加入1.5倍量的甲醇溶解,放置后很訣析出長春鹼結晶。又如蝙蝠葛鹼在乙醚中很難溶解,但當其鹽的水溶液用氨液鹼化,并立即用乙醚萃取,所得的乙醚溶液,放置后即可析出蝙蝠葛鹼的乙醚加成物結晶。



  制備結晶溶液,除選用單一溶劑外,也常采用混合溶劑。一般是先將化合物溶于易溶的溶劑中,再在室溫下滴加适量的難溶的溶劑,直至溶液微呈渾濁,并將此溶液微微加溫,使溶液完全澄清后放置。例如J 一細辛醚重結晶時,可先溶于乙醇,再滴加适量水,即可析出很好的結晶。又如自虎杖中提取水溶性的虎杖 時,在已精制飽和的水溶液上添加一層乙醚放置,既有
利于溶出其共存的脂溶性雜質,又可降低水的极性,促使虎杖俄的結晶化。自秦皮中提取七葉 (秦皮甲素),也可運用這樣的辦法。



   結晶過程中,一般是溶液濃度高,降溫訣,析出結晶的速度也快些。但是其結晶的顆粒較小,雜質也可能多些。有時自溶液中析出的速度太快,超過化合物晶核的
形成勸分子定向排列的速度,往往只能得到無定形粉未。有時溶液太濃,粘度大反而不易結晶化。如果溶液濃度适當,溫度慢慢降低,有可能析出結晶較大而純度較 高的結晶。有的化合物其結晶的形成需要較長的時間,例如鈴蘭毒 等,有時需放置數天或更長的時間。



   4.制備結晶操作:制備結晶除應注意以上各點外,在放置過程中,最好先塞緊瓶塞,避免液面先出現結晶,而致結晶純度較低。如果放置一段時間后沒有結晶析
出,可以加入极微量的种晶,即同种化合物結晶的微小顆粒。加种晶是誘導晶核形成常用而有效的手段。一般他說,結晶化過程是有高度選擇性的,當加入同种分子 或离子,結晶多會立即長大。而且溶液中如果是光學异构體的混合物,還可依种晶性質优先析出其同种光學异构體。沒有种晶時,可用玻璃棒蘸過飽和溶液一滴,在
空气中任溶劑揮散,再用以磨擦容器內壁溶液邊緣處,以誘導結晶的形成。如仍無結晶析出,可打開瓶塞任溶液逐步揮散,慢慢析晶。或另選适當溶劑處理,或再精 制一次,盡可能除盡雜質后進行結晶操作。



   5.重結晶及分步結晶:在制備結晶時,最好在形成一批結晶后,立即傾出上層溶液,然后再放置以得到第二批結晶。晶態物質可以用溶劑溶解再次結晶精制。這
种方法稱為重結晶法。結晶經重結晶后所得各部分母液,再經處理又可分別得到第二批、第三批結晶。這种方法則稱為分步結晶法或分級結晶法。晶態物質在一再結 晶過程中,結晶的析出總是越來越快,純度也越來越高。分步結晶法各部分所得結晶,其純度往往有較大的差异,但常可獲得一种以上的結晶成分,在未加檢查前不
要貿然混在一起。



   6.結晶純度的判定:化合物的結晶都有一定的結晶形狀、色澤、熔點和熔距,一可以作為鑒定的初步依据。這是非結晶物質所沒有的物理性質。化合物結晶的形
狀和熔點往往因所用溶劑不同而有差异。原托品鹼在氯仿中形成棱往狀結晶,熔點207℃;在丙酮中則形成半球狀結晶,熔點203℃;在氯仿和丙酮混合溶劑中 則形成以上兩种晶形的結晶。又如N一氧化苦參鹼,在無水丙酮中得到的結晶熔點208℃,在稀丙酮(含水)析出的結晶為77~80℃。所以文獻中常在化合物
的晶形、熔點之后注明所用溶劑。一般單體純化合物結晶的熔距較窄,有時要求在0.5℃左右,如果熔距較長則表示化合物不純。



  但有些例外情況,特別是有些化合物的分解點不易看得清楚。也有的化合物熔點一致,熔距較窄,但不是單體。一些立體异构體和結构非常類似的混合物,常有
這樣的現象。還有些化合物具有雙熔點的特性,即在某一溫度已經全部融熔,當溫度繼續上升時又固化,再升溫至一定溫度又熔化或分解。如防己諾林鹼在 1760C時熔化,至200℃時又固化,再在2420C時分解。中草藥成分經過同一溶劑進行三次重結晶,其晶形及熔點一致,同時在薄層層析或紙層層析法經
數种不同展開劑系統檢定,也為一個斑點者,一般可以認為是一個單體化合物。但應注意,有的化合物在一般層析條件下,雖然只呈現一個斑點,但并不一定是單體 成分。例如鹿含草中主成分為高熊果砍,异高熊果 极難用一般方法分离,經反复結晶后,在紙層及聚 胺薄層上都只有一個斑點,易誤認為單一成分,但測其熔點
在115~125℃,熔距很長。經制備其甲醚后,再經紙層層析檢定,可以出現兩個斑點,异高熊果 的比移值大于高熊果 。又如水菖蒲根莖揮發油中的α一細 辛醚和β一細辛醚,在一般薄層上均為一個斑點,前者為結晶,熔點63℃,后者為液體沸點296℃,用硝酸銀薄層或气相層忻很容易區分。有時個別化合物(如
氨基酸)可能部分地与層析紙或薄層上的微量金屬离子(如Cu)、酸或鹼形成絡合物、鹽或分解而產生复斑。因此,判定結晶純度時,要依据具體情況加以分析。 此外,高壓液譜、气相層析、紫外光譜等,均有助于檢識結晶樣品的純度。



  C.層析法:



  層析技術的應用与發展,對于植物各類化學成分的分离鑒定工作起到重大的推動作用。如中藥丹參的化學成分在30 年代僅從中分离到3种脂溶性色素,分別稱為丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后進一步的研究,發現除丹參酮Ⅰ為純品外,Ⅱ、Ⅲ、均為混合結晶。此后通過各种層析方
法,迄今已發現15种單體(其中有4种為我國首次發現)。目前新的層析技術不斷發展,隨著層析理論和電子學、光學、計算机等技術的應用,層析技術已日趨完 善。



  一.層析法的基本原理:



層析過程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相”溶劑之間的分配系數之差(分配層析),組分對吸附劑吸附能力不同(吸附層析),和寓子交換,分子的大小(排阻層析)而分离。通常又將一般的以流動相為气體的稱為气相層析,流動相為液體的稱為液相層析。



  一、 吸附層析法(AdsorptionChromatography)



  (一)吸附劑、溶劑与被分离物性質的關系:液一固吸附層析是運用較多的一种方法,特別适用于很多中等分子量的樣品(分子量小于1,000的低揮發性樣品)的分离,尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量樣品如蛋白質、多糖或离子型親水住化合物等的分离。吸附層析的分离效果,決定于吸附劑、溶劑和被分离化合物的性質這三個因素。



  1. 吸附劑:常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚 胺、硅藻土等。



  (1) 硅膠:層析用硅膠為一多孔性物質,分子中具有硅氧烷的交鏈結构,同時在顆



  粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱与硅醇基的含量多少有關。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分,因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17%, 吸附力极弱不能用作為吸附劑,但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化,當硅膠加熱至100~110℃時,硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當溫
度升高至500℃時,硅膠表面的硅醇基也能脫水縮台轉變為硅氧烷鍵,從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往,就不再有吸附劑的性質,雖用水處理亦不能恢复其吸附 活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進行(一般在170cC以上即有少量結合水失去)。



  硅膠是一种酸性吸附劑,适用于中性或酸性成分的層析。同時硅膠又是一种弱酸性陽离子交換劑,其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫离子,當遇到較強的鹼注化台物,則可因离子交換反應而吸附鹼性化合物。



  (2) 氧化鋁:氧化鋁可能帶有鹼性(因其中可混有碳酸鈉等成分),對于分离一些鹼性中草藥成分,如生物鹼類的分离頗為理想。但是鹼性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、
內酯等類型的化合物分离。因為有時鹼性氧化鋁可与上述成分發生次級反應,如异构化、氧化、消除反應等。除去氧化鋁中絢鹼性雜質可用水洗至中性,稱為中性氧 化鋁。中性氧化鋁仍屬于鹼性吸附劑的范疇,本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁,不僅可中和氧化鋁中含有的鹼性雜質,并可使氧化鋁顆粒表
面帶有NO3一或CI一的陰离子,從而具有离于交換劑的性質,适合于酸性成分的層析,這种氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁,用于拄層析的,其粒度 要求在100~160目之間。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶濃流速大慢,易使譜帶擴散。樣品与氧化鋁的用量比,一般在1:20~50之
間層析柱的內徑与柱長比例在1:10-20之向。



  在用溶劑沖洗柱時,流速不宜過快,洗脫液的流速一般以每半~1小時內流出液體的毫升數与所用吸附劑的重量(克)相等為合适。



  (3) 活性炭:是使用較多的一种非极性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌,其次用乙醇洗,再以水洗淨,于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭,最好選用顆粒
活注炭,若為活性炭細粉,則需加入适量硅藻土作為助濾劑一并裝柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分,如氨基酸、糖類及某些 。活性炭的有為吸 附作用,在水溶液中最強,在有机溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱,而有机溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時,則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。活性
炭對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別,可將水溶性芳香族物質与脂肪族物質分開,單 糖与多糖分開,氨基酸与多 分開。



   2.溶劑:層析過程中溶劑的選擇,對組分分离關系极大。在柱層析時所用的溶劑(單一劑或混合溶劑)習慣上稱洗脫劑,用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫
劑的選擇,須根据被分离物質与所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮在用极性吸附劑進行層析時,當被分离物質為弱极性物質,一般選用弱极性溶劑為洗脫 劑;被分离物質為強极性成分,則須選用极性溶劑為洗脫劑。如果對某一极性物質用吸附性較弱的吸附劑(如以硅藻土或滑石粉代替硅膠),則洗脫劑的极性亦須相
應降低。



  在柱層操作時,被分离樣品在 加樣時可采用于法,亦可選一适宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇极性較小的,以便被分离的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的极性。這种极性
的增大是一個十分緩慢的過程,稱為“梯度洗脫”,使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果极性增大過訣(梯度太大),就不能獲得滿意的分离。溶劑的洗
脫能力,有時可以用溶劑的介電常數(ε)來表示。介電常數高,洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅适用于极性吸附劑,如硅膠、氧化鋁。對非极性吸附劑,如活性 炭,則正好与上述順序相反,在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用,較在脂溶性溶劑中為強。



  3.被分离物質的性質:被分离的物質与吸附劑,洗脫劑共同构成吸附層析中的三個要素,彼此緊密相連。在指定的吸附劑与洗脫劑的條件下,各個成分的分离情況,直接与被分离物質的結构与性質有關。對极性吸附劑而言,成分的极性大,吸附住強。



   當然,中草藥成分的整體分子觀是重要的,例如极性基團的數目愈多,被吸附的住能就會更大些,在同系物中碳原子數目少些,被吸附也會強些。總之,只要兩個
成分在結构上存在差別,就有可能分离,關鍵在于條件的選擇。要根据被分离物質的性質,吸附劑的吸附強度,与溶劑的性質這三者的相互關系來考慮。首先要考慮 被分离物質的极性。如被分离物質极性很小為不含氧的 烯,或雖含氧但非极性基團,則需選用吸附性較強的吸附劑,并用弱极性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多
數中藥成分的极性較大,則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑(一般Ⅲ~Ⅳ級)。采用的洗脫劑极性應由小到大按某一梯度遞增,或可應用薄層層析以判斷被分离物在
某种溶劑系統中的分离情況。此外,能否獲得滿意的分离,還与選擇的溶劑梯度有很大關系。現以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑与樣品极性之間的關系。如有 多組分的混合物,象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅膠為吸附劑時,使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫,油脂
中各單一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脫。



  又如對于C- 27甾體皂 元類成分,能因其分字中羥基數目的多少而獲得分离:將混合皂 元溶于含有5%氯仿的苯中,加于氧化鋁的吸附柱上,采用以下的溶劑進行梯度洗
脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁,由于硅酸鎂的吸附性較弱,洗脫劑的极牲需相應降低,亦即采用苯或含5%氯仿的苯,即可將一元羥基皂 元從吸附 劑上洗脫下來。這一例子說明,同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時,需用不同的溶劑才能達到相同的分离效果,從而說明吸附劑、溶劑和欲分离成分三者的
相互關系。



  (二)簿層層析:薄層層析是一种簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上,形成一薄層進行層析時一即稱薄層層析。其原理与柱層析基本相似。



  1.薄層層析的特點:薄層層析在應用与操作方面的特點与柱層析的比較。



   2.吸附劑的選擇:薄層層析用的吸附劑与其選擇原則和柱層析相同。主要區別在于薄層層析要求吸附劑(支持劑)的粒度更細,一般應小于250目,并要求粒
度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過高,以Ⅱ~Ⅲ級為宜。而展開距离則隨薄層的粒度粗細而定,薄層粒度越細,展開距离相應縮短,一般不 超過10厘米,否則可引起色譜擴散影響分离效果。



   3.展開劑的選擇:薄層層析,當吸附劑活度為一定值時(如Ⅱ或Ⅲ級),對多組分的樣品能否獲得滿意的分离,決定于展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性
成分中,大致可按其极性不同而分為無极性、弱极性、中极性与強极性。但在實際工作中,經常需要利用溶劑的极性大小,對展開劑的极性予以調整。



  4‧特殊薄層:針對某些性質特殊的化合物的分离与檢出,有時需采用一些特殊薄層。



   熒光薄層:有些化合物本身無色,在紫外燈下也不顯熒光,又無适當的顯色劑時,則可在吸附劑中加入熒光物質制成熒光薄層進行層析。展層后置于紫外光下照射,薄層板本身顯熒光,而樣品斑點處不顯熒光,即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質多為無机物。其一是在 254nm紫外光激發下顯出熒光的,如錳激洁的硅酸鋅。另一种為在365nm紫外光激發下發出熒光的,如銀激化的硫化鋅硫化鎬。



   絡合薄層:常用的有硝酸銀薄層,用來分离碳原子數相等而其中C 一C雙鍵數目不等的一系列化合物,如不飽和醇、酸等。其主要机理是由于C一C鍵能与硝酸銀形成絡合物,而飽和的C一C鍵則不与硝酸銀絡合。因此在硝酸銀薄
層上,化台物可由于飽和程度不同而獲得分离。層析時飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高,含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的Rf值高,含一個三鍵的較含一個雙鍵的 Rf值高。此外,在一個雙鍵化台物中,順式的与硝酸銀絡合較反式的易于進行。因此,還可用來分离順反异构體。



   酸鹼薄層和PH 緩沖薄層:為了改變吸附劑原來的酸鹼性,可在鋪制薄層時采用稀酸或稀鹼以代替水調制薄層。例如硅膠帶微酸性,有時對鹼性物質如生物鹼的分离不好,如不能展
層或拖尾,則可在鋪薄層時,用稀鹼溶液0.1~0.5NNa0H溶液制成鹼性硅膠薄層。例如豬屎豆鹼在以硅膠為吸附劑時,以氯仿-丙酮一甲醇(8:2: 1)為展開劑Rf<0.1,采用鹼性硅膠薄層用上述相同展開劑,Rf值增至0.4左右。說明豬屎豆鹼為--鹼性生物鹼。



  5.應用:薄層層析法在中草藥化學成分的研究中,主要應用于化學成分的預試、化學成分的鑒定及探索柱層分离的條件。



  用薄層層析法進行中草藥化學成分預試,可依据各類成分性質及熟知的條件,有針對性地進行。由于在薄層上展層后,可將一些雜質分离,選擇性高,可使預試結果更為可靠。



  以薄層層析法進中草藥化學成分鑒定,最好要有標准樣品進行共薄層層析。如用數种溶劑展層后,標准品和鑒定品的Rf值、斑點形狀顏色都完全相同,則可作初步結論是同一化合物。但一般需進行化學反應或紅外光譜等一种儀器分析方法加以核對。



   用薄層層析法探索柱層分离條件,是實驗室的常規方法。在進行柱層分离時,首先考慮選用何种吸附劑与洗脫劑。在洗脫過程中各個成分將按何种順序被洗脫,每
一洗脫液中是否為單一成分或混合體,均可由薄層的分离得到判斷与檢驗。通過薄層的預分离,還可以了解多組分樣品的組成与相對含量。如在薄層上摸索到比較滿 意的分离條件,即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分离條件經适當改變,轉至一般往層所采用洗脫的方式進行制備柱分离。利用薄層的預分离尋找柱層的
洗脫條件時,假定在薄層上所測得的Rf值一樣品在柱層中的比移率(R)。這是由于在薄層展開時,薄層固定相中所含 的溶劑經過不斷的蒸發,而使薄層上各點位置所含的溶劑量是不等的,靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴格控制層析操作條件,則可得到接近真實的
Rf值。用薄層進行某一組分的分离,其Rf值范圍,一般情形下為0.85>Rf>0.05。此外,薄層層析法亦應用于中草藥品种、藥材及其制劑真偽的檢 查、質量控制和資源調查,對控制化學反應的進程,反應副產品產物的檢查,中間體分析,化學藥品及制劑雜質的檢查,臨床和生化檢驗以及毒物分析等,都是有效
的手段。



 




http://www.cintcm.com/cgi-bin/bigate.cgi/b/k/k/http@www.cintcm.com/lanmu/zhongyiao/zhongyao_huaxue/huaxue_jiandingff.htm




中藥化學成分提取、分离和鑒定的方法

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