Julia Chen

    台北市立第一女子高級中學

        校內科展作品說明書

 

 

 科別:生物組

 

 編號:

 

作品名稱:

     天然物抗自由基之研究

(I)       
以超微量化學發光法評估

   市售飲料之抗氧化能力

(II)  皂素對前列腺癌細胞抗氧

   化力之探討

 

 班級:二年溫班

 

     指導老師: 陳怡盱老師

         呂鋒洲教授

 

     作者:
陳彥蓁 蘇怡恬

題目：天然物抗自由基之研究

研究一：以超微量化學發光法評估市售飲料之抗氧化能力

一.     研究動機：

 

有一天在報紙上看到有關急凍人的報導，知道有些人發病原因是由於遺傳基因上缺少一種對抗自由基的酵素，因而引起脊髓運動神經元的破壞退化，導致漸漸無法行動，這引起了我們對自由基的注意，再加上看到一些醫學雜誌與報導，發現自由基的探討在近幾年是醫學上的熱門話題，知道一些因腦細胞退化引起的疾病，例如老年癡呆症或巴金森氏症，其中一個可能的致病機轉與自由基的傷害有關。而在電視上也常可看到抗自由基的食品促進健康的廣告，更加引起我們對自由基與健康的關係產生興趣，於是我與同學便開始蒐集一些自由由基的資訊。

 

自由基是帶有未配對電子(unpaired
electron)的原子或分子。自由基的種類很多
,且大多是瞬間產生 ,而對人體會產生重大影響的主要包括超氧自由基(superoxide)﹑氫氧自由基(hydroxyl
radical)﹑及能產生自由基的活性氧物質，例如單線態氧(singlet
oxygen)﹑過氧化脂質(lipid
peroxide)和過氧化氫(hydrogen
peroxide)等。由於自由基必須拉取附近電子加入其中 ,以保持安定 ,而這些被攻擊的目標往往是構成細胞基本結構的物質，如蛋白質﹑醣類﹑脂肪等, 當這些物質形成自由基後 ,又會再去攻擊其他物質所帶有的的電子 , 形成惡性循環的「自由基連鎖反應」,不僅會破壞細胞、酵素、核酸、蛋白質結構，假若長年累月在人體中蓄積，還會影響身體的正常運作功能，且與冠狀動脈硬化、關節炎、胃潰瘍、尿毒症、糖尿病等文明並關係密切，甚至與癌症、衰老有密切關係。

 

自由基在體內會形成如此重大的破壞，我們實在應該重視。俗語說，預防勝於治療，我們想，如果能利用一些飲食或藥膳就能增進身體對抗自由基的能力，不是很好嗎?

於是便著手有關健康食品或一些皂素或維他命其抗氧化能力的探討。

 

二. 研究目的：

  

    近來茶類飲料被視為健康聖品而大為風行
,年輕人也幾乎人手一瓶飲料捨白開水而不飲，如此跟我們生活息息相關的飲料對我們有何影響呢，於是激起了我們對研究茶類飲料及其他健康食品成分抗氧化能力程度的興趣。本研究擬以超微量化學發光法評估市售茶類飲料及其他健康食品成分的抗氧化能力
, 以印證茶類飲料在抗氧化能力上的功用，並看看何種茶飲料對抗氧化有較佳的效果。

 

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三. 實驗器材:

（一）[儀器]

    化學發光 (chemiluminescence)之測定採用Chemiluminescence Analyzing System (Tohoku Electronic
Industrical CO, Sendai, Japan) 的超微量化學

發光分析儀系統(F.J.Lu, J.T.Lin, H.P.Wang and W.C  Hung. A Simple

Sensitive,non-stimulated
photon counting System to detection of superoxide anion in whole blood.
Experientia.56.141-144,1996) 。

此部超微量化學發光儀之設備包括有: (1)光子檢測器
(photon detector, Model CLD-110) , (2)化學發光計測器(chemiluminescence counter, Model CLC-10) , (3)水浴循環器(water circulator Model CH-20) , (4)個人電腦 (32bit IBM personal computer system) , 水循環器連接到檢測器 ,水浴循環器之溫度為6℃
,光子檢測器(Model CLD-110)可以檢測到10^-15w之微弱能量。

 

（二）[試劑]

    [X] :  
 過氧化氫H2O2 : 250mM  0.6ml

          
 配15ml: 取8M之H2O2(aq) 469ll ,加50%之MeOH至15ml。

        

    [Y] :

 

統一	純喫茶（綠茶）、（紅茶）, 統一麥香紅茶、綠茶、奶茶 , 統一菊花茶、杏仁茶 , 統一伴點巧克力奶茶
光泉	鮮喝茶（紅茶）、（綠茶）, 光泉檸檬紅茶、梅子綠茶、柳橙茶、英格蘭紅茶
雀巢	檸檬茶、萊姆茶、柳橙茶、蜜桃茶
立頓	巧克力奶茶、 奶茶、冰檸檬紅茶
可果美	蕃茄汁 ,田園生活蔬菜汁; 義美台灣西瓜汁;波蜜果菜汁;烏龍茶包;新鮮蕃茄汁
Saponin 皂素	20ug、500ug 各 0.3 ml
Trolox (水溶性維他命E）	50ug , 0.3 ml

                                                                                                                                                          
                                 

    [Z] :  
 乙醛 MeCHO
: 379 mM  0.6ml

            配15ml : 取MeCHO(l) 321ll ，50%之甲醇MeOH至15ml。

 

 

 

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四. 研究過程或方法:

（一）[原理]     

     此方法之原理是根據日本學者Okubo所提的公式即P=K
[X] [Y] [Z]測量抗氧化物質Y ，以其化學發光(chemiluminescence)的強度P來判斷抗氧化物質清除自由基的能力。公式中之X為能產生自由基的活性氧物種
(Reactive Oxygen Species,ROS), 本實驗採用
H2O2, Y 為抗氧化劑，即為所加入之sample
(各式茶飲料,水溶性維他命E: trolox或皂素saponin...等) , z為穩定的自由基接受體
(free radical receptor)本實驗使用為 乙醛acetaldehyde(MeCHO) , K為常數。

   

根據Okubo之學理, 抗氧化劑 Y在消除
ROS(X*) 所釋放之自由基後 , 可能會轉變成下列2種情況 :

                        

              X*

                        

                                  Z 

      Y                Y*(1)                   Y + hv

       

                       Y*(2)                   Y + hv

                         

              X

                       

P = X* .Y. Z

              

(1)  Y轉變為Y*後,在自由基接受體(Z)之幫助下,將自由基傳給Z，以能量(hv)

   之形式放出。

   
(2) 當Y為混合物或具有特殊官能基例如共軛雙鍵(conjugated double

         bond)時,其與X反應後所獲得之自由基以2種方式處理
:

        I. 將自由基傳給混合物中具有Z功能之某化合物,然後以發光之方式

         釋放自由基
。

    
   II.將自由基傳給特殊官能基 ,再經由共振作用以發光之方式釋放

         自由基 ,本身恢復原狀。

 

  上述之反應所發出的化學光 (能量的形式在物理學上稱為"化學放光或

 
冷光"
(chemiluminescence,CL)其強度和X.Y.Z的濃度成正比,比例常數為
K。

 

 

          

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    但後來實驗時又發現有些sample在不加 Z
(acetaldehyde)的情況下,

依舊會發化學冷光 (chemiluminescence) , 如以上之第二種情況
。而經

大量實驗證明日人 Okubo 的理論 P =
K [X] [Y] [Z] 可在此情況下簡化為

P = K [X] [Y]’ 因此我們的
實驗便針對以上兩種理論一起做設計 ,最後再

互作比較。

 

（二）[方法]  

(1) 有加 Z (乙醛acetaldehyde, MeCHO)者：

       在小盤子內放入0.6ml 250mM H2O2及 0.6ml, 379mM (MeCHO ,溶於

       50% methanol) , 把盤子放入超微量化學發光儀之暗室(chamber)內, 溫度

       37℃ ,經過 200秒之穩定後，入0.3
ml之Y(市售茶飲料、saponin、

       trolox）, 每10秒測定一次化學發光之強度 ,共延續測定220秒 ,最後以

       積分方式計算200至420 秒間之化學發光之總值。

 

 (2) 不加Z(MeCHO)者：

       重複以上步驟 ,但將0.6
ml, 379 mM acetaldehyde改以
0.6ml 50%

        methanol (MeOH) 代替(附註)。

 

 #附註 : Methanol沒有可作為自由基接受體的功能。而試劑皆是泡在50%的

           Methanol中, 故以此代替有Z功能acetaldehyde ,不會增加另一

          
種物質來影響實驗結果,亦可使盤子中溶液總量維持在1.5 ml，儘

           可能減少了實驗的變因。

 

 

五. 實驗結果:

    經由實驗我們做了非常多的茶類飲料，在此將所有sample的P與P’等實驗據整理表列出來(見Table1~5)。在實驗討論方面，我們特別挑出其中幾種較具有特殊代表意義的飲料，來做詳細的說明與探討。由實驗結果發現，光泉鮮喝茶(綠茶)與立頓檸檬紅茶其P與P’的比值極高(超過100%) ;另外有許多飲料P與P’值均很高，但P/P’之值卻低於30%以下，最特別的是伴點巧克力奶茶，其P與P’值均超過10萬，P/P’值卻只有12.3%;而石鹼saponin 之P與P’及P/P’值均不高。所有詳細資料請見fig.1~4, Table1~5。

   

 

 

 

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六. 討論:

  過氧化氫H2O2是極具殺傷力的活性氧物質 , 其之所以擁有強大的破壞力,是因為具有兩項特點 : 一.它擁有極佳的通透能力,能自由滲透細胞膜進入細胞。二.它在細胞內一遇到金屬離子便會發生芬通反應(Fenton reaction)(註) ,而產生活性極強的氫氧自由基(Hydroxyl
radical)。而氫氧自由基能引起DNA鹼基的氫氧化 ,造成突變。此外，氫氧自由基也會攻擊花生四烯酸(Arachidonic
acid),激發脂質過氧化作用產生脂質過氧化物，進而破壞細胞膜雙層磷脂質。另外也會分解成具有毒性的醛類(aldehydes),毒害細胞。由於活性氧物質對細胞的危害甚大 ,而細胞又無可避免會產生活性氧物質,故人體內有三個司職抗氧化任務的酵素系統
: 超氧化物歧化脢(superoxide dismntase,簡稱SOD)﹑過氧化氫(catalase)﹑榖胱甘肰過氧化脢
(glutathione peroxidase,GSH-PX) ; 另外，非酵素性的抗氧化物如維生素A﹑C﹑E及β胡蘿蔔素都有消除自由基、抗氧化的作用。其中維生素E可當作細胞膜的自由基掃除劑 , 防止多元不飽和脂肪酸的脂質過氧化作用。這種抗氧化特性可能就是維生素E抗癌的機轉,它作用在癌的起始期(initation)和促進期(progression)上。維生素E也可以在起始期阻斷亞硝胺(nitrosamine)之形成,並在促進期影響免疫系統。補充維生素E可以增加體液抗體及細胞調控的免疫能力
; 最後功能則是具有抗腫瘤的增殖能力,並可以調控基因的表現。

 

註:芬通反應:

                O₂^·-  +  Fe³⁺
→ O₂  + Fe²⁺

              H2O2 
+  Fe²⁺ →
Fe³⁺ + OH^- +OH

 

   我們由實驗比較沒加Z(acetaldehyde)及有加Z的結果 ,歸納出以下重點:

   

(1)      
 P的值(指實驗中所發出的化學冷光chemiluminescence之量)愈大抗氧化

    能力愈好(註一)。

 

(2)      
 P(沒加Z acedaldehyde者)與P'(有加Z者)的比值愈大，試劑本身抗氧化能力愈好(註二)。    

     

 # 註一 : 超微量化學發光儀的目的在於測出自由基被消除時,反應進行時所放出化

          學冷光之量。其中Z(即加入的乙醛)可說是做為一種觸媒的作用。當Y

在200秒時打入
,自由基的消除反應才開始順利進行。因此實驗結果中P

的曲線會升高。為了比較Y抗自由基的能力,就必須觀察P(化學冷光)的量。我們便以計算面積的方式來觀察並作比較。

 

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 # 註二 : Z為自由基接受體
,有加Z時可看出Y對自由基真正的處理能力。

故比值（P/P’）愈大時表示Y獨立對抗自由基的能力與它實際上真正能處

理自由基的能力愈相近 ,也就代表抗氧化能力愈好。由於實驗中X(H2O2)，屬於人體內所產生的自由基
,Y為我們攝取入人體內的健康食品 ,但Z為人體中沒有並且對人體有害的物質。故縱使有加Z時放出的化學冷光量很高也是無用
,因為人體中不會有Z。故主要是比較沒加Z時 ,Y單獨處理自由基的能力。

 

(3). 我們由實驗得知所有市面的茶飲料當中 , 大部分的P值均比P'值低 , 顯示雖然

大部分的茶飲料有微量的抗氧化能力 , 但都需加Z才有更強的清除自由基能力,

只有發現光泉鮮喝茶(綠茶) 比值高達112.1% (見Fig.1
,Table2), 顯示這一種茶飲本身即有很強的抗氧化能力
, 算是在所有茶飲中一枝獨秀。

 

(4). 而不加Z作為自由基接受體就無法完成消除自由基的反應,且本身抗氧化能力

(P值)就很低的是統一杏仁茶、光泉檸檬紅茶、
雀巢蜜桃茶,可能原因是其中含人工香料較多,天然茶或果汁成分很低之故
。(見Table 1-5)

 

(5). 統一伴點巧克力奶茶的P值最高。但因其P’值更高，所以P比 P’之比值很低

 (只有12.3%，見Fig.2
, Table 1) ,所以也不是理想的清除自由基飲料。我們發現大多數奶茶其P值十分高，可能是奶茶裡面的成分較複雜，雖然可以偵測到冷光，但也有可能是本身成份內自己電子的流動而非針對自由基的清除 , 所以其 P'值很高，表示需加Z 才有清除自由基能力，而非本身具抗氧化力。

 

(6). 雀巢系列飲料(見Table 3)，其抗氧化作用力幾乎全軍覆沒,可能是因為人工添加物。

 

(7). 可果美蕃茄汁、義美台灣西瓜汁、波蜜果菜汁、新鮮蕃茄汁在此次實驗中均有良

好的抗氧化效果,建議多吃新鮮水果。(Table
5)

 

(8). 測 Trolox 圖形高起後便逐漸下降(Fig.
3)，顯示其抗自由基的能力極佳，在短時間內便完成反應
, 意味著維生素E