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天然多酚類化合物之抗發炎、抗癌及誘導腦血管舒張之活性研究
1台北醫學大學生藥學研究所、2醫學系皮膚學科
陳彥州1*、林慧宜1、柯景懷1、沈杏娟2
在二十一世紀的今天科學日新月異、醫藥技術不斷的進步，但對於諸多重大疾病如癌症、敗血症或腦血管異常相關疾病如中風、高血壓等威脅人類健康的重大疾病，在西方醫學中卻仍然缺乏有效的治療或預防方式。反觀我們具有數千年悠久歷史的中國傳統醫學，對於一些在西方醫學感到相當棘手的疾病確有顯著而神奇的療效。但是中國傳統醫藥至今仍然無法廣為西方醫學所接受最大的問題就在於無法提出科學化的證據，來確定其真正的醫療機轉。因此，自傳統中草藥中篩選並研發出具有醫療潛力之有效成份及找出真正作用的機制不但是我國中草藥未來進軍國際市場的重要方向,更是醫藥界極具挑戰性及前瞻性的研究領域。本文主要是整合實驗室與近年來其他相關研究報告分別針對中草藥所含之多酚類化合物在抗發炎反應、抗癌以及對腦血管收縮或舒張的影響等作介紹。
一、 天然多酚類化合物之抗發炎活性探討
多酚類（Polyphenol）化合物廣泛存在於各種天然植物中，根據文獻記載多酚類化合物具有特殊的生物活性如抗氧化作用及清除自由基的能力(1,2)。原本動物體內適量的發炎反應,可活化免疫細胞進而殺死入侵的病菌,是人體內防禦系統中不可或缺的一環，其。但是太過劇烈的發炎反應則會造成組織細胞急劇的壞死與血壓急速下降進而導致死亡(3)。自由基的種類相當繁多,包括(一氧化氮, 氫氧基，過氧化氫，超氧自由基等)，其中一氧化氮 (NO)在發炎反應過程中扮演相當重要的角色。NO生成主要是經由活化一氧化氮合成酵素(NOS)而將細胞內之L-arginine轉變成為L-citrulin及NO自由基的釋放(4)。細胞內 NOS主要分為兩大類；一為結構性NOS(constitutive NOS; cNOS)，另一種為誘導型NOS (inducible NOS; iNOS)。 cNOS產生固定量之NO為維持體內正常運作之重要訊息傳遞因子，NO會藉由促使GDP轉變為cGMP進而誘發一連串之生理反應，包括血管擴張、子宮平滑肌鬆弛及抑制血小板凝集等作用。相反的，iNOS所誘導出之大量NO自由基則會造成細胞的傷害與血管過度的舒張最後造成嚴重的發炎反應以及併發症，如敗血性休克、中風、DNA受損、突變所造成細胞的癌化等。因此, 從天然物多酚類中篩選出具有抑制誘導型NOS (iNOS) 所產生的NO，而本身對結構型NOS所產生的NO沒有影響之化合物為一重要之研究方向。 除了NO以外，某些細胞激素(Cytokine)如PGE2、TNF-a、IFN-g、IL-2、IL-8等在發炎反應過程中也扮演重要的角色(5)。例如在感染的過程中, 葛蘭氏陰性與陽性菌細胞壁成份中之Lipopolysaccharde (LPS)與Lipoteic acid (LTA)。均會誘導大量NO、PGE2與細胞激素的產生而進而引起發炎反應，嚴重時甚至會引發敗血性休克而造成病人的死亡(6, 7)。我們的研究中發現某些天然多酚類化合物如oroxylin A, quercetin, wogonin, flavone, 3-OH flavone 等均能有效抑制LPS與LTA所誘導的NO產生，其中oroxylin A 與wogonin則為中藥黃芩中的主成份之一。而Oroxylin A與wogonin之所以能夠抑制LPS誘導之NO產生主要是藉由抑制細胞內轉錄因子NF-kB的活化, 進而導致細胞內誘導型NOS之表現受到抑制所致(8, 9)。在研究中我們也發現Oroxylin A與wogonin也同樣具有抑制LPS誘導之PGE2產生的能力。至於結構相似的Flavone亦會抑制LPS 或LTA所誘導之NO表現, 結果顯示Flavone第3個C上之氫氧基對抑制NO產生活性而言是很重要的，而且Flavone化合物結構上之氫氧基數目越多其抗氧化能力越強, 且降低LPS誘導之NO的能力亦越強。根據以上的研究結果顯示: 天然多酚類化合物在對LPS或LTA誘導之發炎相關因子如NO、PGE2、TNF-a、IFN-g等的產生有明顯的抑制作用，值得進一步探討其作用的機轉與進行活體動物試驗。
二、天然多酚類之抗癌活性研究
近十年來癌症在國人十大死因排行榜中一直名列前矛，科學家們在癌症的研究上也投注相當多的時間與心力，但截至目前為止仍然有許多問題無法克服，例如抗藥性或癌轉移等問題，雖然相較於以往，在面對各種癌症病人的治療時有多種不同的化療藥物可供選擇，但令人困擾的是即使選擇不同的化學治療藥物，一段時間的投予之後經常同樣會出現所謂抗藥性的問題，以至於藥物無法再有效的殺死癌細胞，因此，研發更有效的抗癌藥物或具有癌症預防效果的藥物是重要的研究方向。癌症的發生與暴露於環境中化學性、物理性及病毒性致癌因子 (carcinogens)的量有直接的關係。這些致癌因子會經由基因突變而導致正常細胞癌化。癌症的發生為一多步驟性的致癌過程(multistep carcinogenesis),分成(1)起始期 (initiation phase)為一快速且不可逆的階段，主要由於細胞內的核酸發生突變所致；(2)促進期 (promotion phase)是由於一些致癌原作用，造成基因異常所致；(3)進展期 (progression phase)為癌細胞開始侵犯鄰近正常組織，進而轉移至其他組織或器官。因此能夠在任一時期阻斷癌細胞的進程者，皆為我們尋找天然抗癌藥物的重要目標。
目前在癌症的研究領域上主要分為兩大方向，第一為抗癌能力的研究，在此研究方向主要是以篩選或研發能夠專一性誘導癌細胞進行細胞凋亡(apoptosis)作用，而對正常細胞產生的毒性卻不高的藥物。藉由藥物所誘導的細胞凋亡進而達到殺死癌細胞的作用，比傳統藥物所引發的細胞壞死(necrosis)可在病人體內引起較低的副作用，因為癌細胞透過細胞凋亡的方式死亡後，較不易引發大範圍的週邊組織發炎或感染反應，避免對於病人產生更大的傷害(10, 11)。天然植物多酚類化合物被證實在對正常細胞沒有細胞毒性的藥物濃度下，可以成功的誘導多種癌細胞進行細胞凋亡(12, 13)，我們研究中也發現curcumin，wogonin 與fisetin 等天然化合物能誘導直腸癌細胞與血癌細胞進行細胞凋亡，而其凋亡的機轉主要是透過活細胞內的蛋白酵素caspase 3 與細胞核內的核酸水解酵素所致(Ca+2-dependent DNase) (14)。目前這些在in vitro實驗模型中被證實具有殺死癌細胞的有效成份正著手進行 in vivo 動物實驗來更進一步確定其在動物體內的功效。另一個研究方向主要是針對癌症預防方面，此一研究領域主要是朝向如何利用天然藥物來預防或降低癌症的發生。利用致癌劑12-ο-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)來誘導細胞進行癌化作用，同時觀察天然物對此癌化作用的影響程度是現今常用的化學預防藥物篩選研究模式。TPA本身是很強的細胞癌化促進劑，在動物皮膚試驗及細胞實驗中均證實 TPA 之所以能夠促進細胞癌化是經由活化細胞內的訊息傳導路徑，如蛋白激素之活化(PKC)、致癌基因c-Jun/c-fos之誘導與活化細胞增生的相關酵素如MAPK、JNK等。在癌症的發生與TPA所誘導之癌化作用上，天然多酚類化合物已被證明確實可以有效的抑制癌化作用進行(15, 16)。另外，我們的研究結果也證實天然多酚類如茶多酚(EGCG，TF3)、一些 flavanones的化合物如 flavanone、 2，-OH flavanone、4，-OH flavanone、6-OH flavanone能有效抑制TPA誘導的NIH3T3細胞增生與抑制PKC、c-Jun/c-fos與MAPK之活化。在分析Flavanones 抑制TPA誘導活性結構相關性(structure activity relationship)時發現 2′-OH flavanone為最明顯有效之-OH官能基鍵結位置。接下來，我們將以老鼠表皮癌化模式來證實這些化合物之預防細胞癌化之in vivo 活性。
三、天然多酚類化合物對腦血管之影響
由於人類平均壽命的延長、老年人口的急速增加，因此對於腦血管相關疾病如高血壓、中風等的預防或治療日益重要。由於血腦障壁的結構相當特殊而緊密，一般藥物很難到達，因此開發對腦血管疾病有療效的藥物是刻不容緩的。腦血管的構造可分為內皮細胞層、平滑肌細胞層與外層的結締組織。內皮細胞層與平滑肌細胞層是調控腦血管舒張或縮收之所在。天然多酚類化合物對腦血管之活性目前仍較少研究。為了探討多酚類化合物對腦血管之效用，我們以豬的腦血管當材料，以in vitro tissue bath的方式來探討多酚類化合物對腦血管收縮與舒張之影響。研究結果顯示中藥黃芩萃取物oroxylin A能有效誘導腦血管舒張，其舒張與內皮細胞層存在與否無關。L-arginine 相似物N-nitro-L-arginine(NLA)與N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)前處理並無法抑制oroxylin A所誘導之腦血管舒張，這結果指出NO沒有包含在oroxylin A誘導之腦血管舒張。進一步以一些藥理結抗劑來證實其作用機轉發現當以鉀離子通道阻斷劑如TEA, 4-AP與iberiotoxin前處理時oroxylin A誘導的腦血管舒張能顯著的被抑制。此結果顯示oroxylin A誘導腦血管舒張可能經由活化鉀離子通道所致。因為我們先前已證實oroxylin A 在RAW264.7巨噬細胞中能抑制LPS誘導的誘導型NOS之產生。因此我們進一步探討oroxylin A對LPS誘導之腦血管舒張之影響。一些研究發現LPS能經由活化血管平滑肌細胞中的誘導型NOS而導致血管過度舒張，進而造成血壓過低，最後導致死亡。在我們實驗中發現L-arginine能有效誘導LPS前處理過的腦血管舒張，此舒張作用能被L-arginine相似物NLA與L-NAME有效的抑制。當腦血管前處理在oroxylin A與LPS存在的情形下，L-arginine誘導之腦血管舒張有明顯的被抑制。免疫組織染色法發現LPS處理的腦血管，誘導型NOS在血管的平滑肌細胞層大量表現，oroxylin A能有效抑制其表現(圖一)。我們也同時以組織培養的方法培養腦血管的平滑肌細胞，接著以抗平滑肌細胞b-actin之抗體來確定所培養之平滑肌細胞，結果顯示出95%的細胞為平滑肌細胞。以抗誘導型NOS抗體偵測發現LPS處理能誘導平滑肌細胞內誘導型NOS蛋白大量表現，而oroxylin A能有效抑制誘導型NOS蛋白大量表現 (圖二)。以上結果顯示oroxylin A能有效誘導腦血管舒張，同時，也可抑制LPS誘導腦血管平滑肌細胞誘導型NOS之表現。
綜合我們與一些先前的研究結果證實天然多酚類化合物確實具有很多有利的生物活性，如抗發炎，抗自由基，抗癌與防癌等活性。雖然天然物具有這麼多有效的活性，然而其缺點為有效濃度較高且專一性較差。目前一些研究以將天然多酚類化合物的角色定位於輔佐之用。換言之，就是結合天然多酚類化合物與一些臨床藥物分析其療效。已有報導指出這種處理方式能降低藥物使用劑量、減少抗藥性的產生與使藥物療效加倍。在我們抗發炎研究方面，我們也研究結合L-arginine相似物(NLA與L-NAME)與天然多酚類化合物如wogonin, baicalin 與baicalein來處理LPS誘導之NOS與COX-2之表現。實驗結果顯示wogonin, baicalin 與baicalein能有效抑制NO之產生同時也可以抑制L-arginine相似物(NLA與L-NAME)所刺激之NOS與COX-2表現。老鼠體內實驗來評估結合L-arginine相似物(NLA與L-NAME)與天然多酚類化合物對LPS誘導之影響實驗目前正在進行中。
圖一：以組織免疫螢光染色法偵測Oroxylin A 抑制LPS誘導腦血管之iNOS蛋白表現。(A)對照組；(B)LPS處理腦血管24小時；(C)LPS+Oroxylin A (60 mM)處理腦血管24小時。M代表平滑肌細胞所在；A為結締組織所在
圖二：以免疫螢光染色法偵測Oroxylin A抑制LPS誘導腦血管平滑肌細胞iNOS蛋白之表現。
四、參考文獻
1. Medina I, Satue-Gracia MT, German JB and Frankel EN. (1999) Comparison of natural polyphenol antioxidants from extra virgin olive oil with synthetic antioxidants in tuna lipids during thermal oxidation. J Agr Food Chem 47: 4873-9.
2. Lopes GK, Schulman HM and Hermes-Lima M. (1999) Polyphenol tannic acid inhibits hydroxyl radical formation from fenton reaction by complexing ferrous ions. Biochim Biophys Acta 1472: 142-152.
3. Bellingan G. (1999) Inflammatory cell activation in sepsis. Brit Med Bull 55:12-29.
4. Chen YC, Lin-Shiau SY and Lin JK. (1998) Involvement of reactive oxygen species and caspase 3 activation in arsenite induce apoptosis. J Cell Physiol 177: 324-333.
5. De Groot CJ, Ruuls SR, Theeuwes JW, Dijkstra CD and Van der Valk P. (1997) Immunocytochemical characterization of the expression of inducible and constitutive isoforms of nitric oxide synthase in demyelinating multiple sclerosis lesions. J Neuropathol Exp Neurol 56: 10-20.
6. Salkowski CA, Detore G, McNally R, van Rooijen N and Vogel SN. (1997) Regulation of inducible nitric oxide synthase messenger RNA expression and nitric oxide production by lipopolysaccharide in vivo: the roles of macrophages, endogenous IFN-gamma and TNF receptor-1-mediated signaling. J Immunol 158: 905-912.
7. Mello SB, Novaes GS, Laurindo IM, Muscara MN, Maciel FM and Cossermelli W. (1997) Nitric oxide synthase inhibitor influences prostaglandin and interleukin-1 production in experimental arthritic joints. Inflammation Res 46: 72-77.
8. Chen YC, Yang LL and Lee TJF. (2000) Oroxylin A inhibition of LPS-induced iNOS and Cox-2 gene expression via suppression of NF-kB activation. Biochem Pharmacol 59: 1445-1457.
9. Chen YC, Shen SC, Chen LC, Lee TJF and Yang LL. (2001) Wogonin, baicalin and baicalein inhibition of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase2 gene expression induced by NOS inhibitors and lipopolysaccharide. Biochem Pharmacol (accepted)
10. . Chen YC, Lin-Shiau SY and Lin JK. (1999) Involvement of p53 and HSP70 proteins in attenuation of UVC-induced apoptosis by thermal stress in hepatocellular carcinoma cells. Photochem Photobiol 70: 78-86.
11. Chen YC and Lin JK. (1996) Photodynamic anticancer agent merocyanine 540 inhibits cell growth by apoptosis. Anticancer Res 17: 224-234.
12. Wenzel U, Kuntz S, Brendel MD and Daniel H. (2000) Dietary flavone is a potent apoptosis inducer in human colon carcinoma cells. Cancer Res 60:3823-3831.
13. Mariadason JM, Corner GA and Augenlicht LH. (2000) Genetic reprogramming in pathways of colonic cell maturation induced by short chain fatty acids: comparison with trichostatin A, sulindac and curcumin and implication for chemoprevention of colon cancer. Cancer Res 60: 4561-4572.
14. Chen YC, Kuo TC, Lin-Shiau SY and Lin JK. (1996) Induction of HSP70 gene expression by modulation of Ca+2 ion and intracellular p53 protein by curcumin in colorectal carcinoma cells. Mol Carcinogen 17: 224-234.
15. Chen YC, Liang YC, Lin-Shiau SY, Ho CT and Lin JK. (1999) Inhibition of TPA induced protein kinase C and transcriptionactivator protein-1 binding activities by theaflavin-3, 3’-diagallate from black tea in NIH3T3 cells. J Agr Food Chem 47: 1416-1421.
16. Liang YC, Chen YC, Lin YL, Lin-Shiau SY and Lin JK. (1999) Inhibition of EGF kinase activity by theaflavin-3, 3’-digallate from black tea. Carcinogen 20: 733-736.
http://biometrics.sinica.edu.tw/nsc/article/v15_04/article2.php3
1台北醫學大學生藥學研究所、2醫學系皮膚學科
陳彥州1*、林慧宜1、柯景懷1、沈杏娟2
在二十一世紀的今天科學日新月異、醫藥技術不斷的進步，但對於諸多重大疾病如癌症、敗血症或腦血管異常相關疾病如中風、高血壓等威脅人類健康的重大疾病，在西方醫學中卻仍然缺乏有效的治療或預防方式。反觀我們具有數千年悠久歷史的中國傳統醫學，對於一些在西方醫學感到相當棘手的疾病確有顯著而神奇的療效。但是中國傳統醫藥至今仍然無法廣為西方醫學所接受最大的問題就在於無法提出科學化的證據，來確定其真正的醫療機轉。因此，自傳統中草藥中篩選並研發出具有醫療潛力之有效成份及找出真正作用的機制不但是我國中草藥未來進軍國際市場的重要方向,更是醫藥界極具挑戰性及前瞻性的研究領域。本文主要是整合實驗室與近年來其他相關研究報告分別針對中草藥所含之多酚類化合物在抗發炎反應、抗癌以及對腦血管收縮或舒張的影響等作介紹。
一、 天然多酚類化合物之抗發炎活性探討
多酚類（Polyphenol）化合物廣泛存在於各種天然植物中，根據文獻記載多酚類化合物具有特殊的生物活性如抗氧化作用及清除自由基的能力(1,2)。原本動物體內適量的發炎反應,可活化免疫細胞進而殺死入侵的病菌,是人體內防禦系統中不可或缺的一環，其。但是太過劇烈的發炎反應則會造成組織細胞急劇的壞死與血壓急速下降進而導致死亡(3)。自由基的種類相當繁多,包括(一氧化氮, 氫氧基，過氧化氫，超氧自由基等)，其中一氧化氮 (NO)在發炎反應過程中扮演相當重要的角色。NO生成主要是經由活化一氧化氮合成酵素(NOS)而將細胞內之L-arginine轉變成為L-citrulin及NO自由基的釋放(4)。細胞內 NOS主要分為兩大類；一為結構性NOS(constitutive NOS; cNOS)，另一種為誘導型NOS (inducible NOS; iNOS)。 cNOS產生固定量之NO為維持體內正常運作之重要訊息傳遞因子，NO會藉由促使GDP轉變為cGMP進而誘發一連串之生理反應，包括血管擴張、子宮平滑肌鬆弛及抑制血小板凝集等作用。相反的，iNOS所誘導出之大量NO自由基則會造成細胞的傷害與血管過度的舒張最後造成嚴重的發炎反應以及併發症，如敗血性休克、中風、DNA受損、突變所造成細胞的癌化等。因此, 從天然物多酚類中篩選出具有抑制誘導型NOS (iNOS) 所產生的NO，而本身對結構型NOS所產生的NO沒有影響之化合物為一重要之研究方向。 除了NO以外，某些細胞激素(Cytokine)如PGE2、TNF-a、IFN-g、IL-2、IL-8等在發炎反應過程中也扮演重要的角色(5)。例如在感染的過程中, 葛蘭氏陰性與陽性菌細胞壁成份中之Lipopolysaccharde (LPS)與Lipoteic acid (LTA)。均會誘導大量NO、PGE2與細胞激素的產生而進而引起發炎反應，嚴重時甚至會引發敗血性休克而造成病人的死亡(6, 7)。我們的研究中發現某些天然多酚類化合物如oroxylin A, quercetin, wogonin, flavone, 3-OH flavone 等均能有效抑制LPS與LTA所誘導的NO產生，其中oroxylin A 與wogonin則為中藥黃芩中的主成份之一。而Oroxylin A與wogonin之所以能夠抑制LPS誘導之NO產生主要是藉由抑制細胞內轉錄因子NF-kB的活化, 進而導致細胞內誘導型NOS之表現受到抑制所致(8, 9)。在研究中我們也發現Oroxylin A與wogonin也同樣具有抑制LPS誘導之PGE2產生的能力。至於結構相似的Flavone亦會抑制LPS 或LTA所誘導之NO表現, 結果顯示Flavone第3個C上之氫氧基對抑制NO產生活性而言是很重要的，而且Flavone化合物結構上之氫氧基數目越多其抗氧化能力越強, 且降低LPS誘導之NO的能力亦越強。根據以上的研究結果顯示: 天然多酚類化合物在對LPS或LTA誘導之發炎相關因子如NO、PGE2、TNF-a、IFN-g等的產生有明顯的抑制作用，值得進一步探討其作用的機轉與進行活體動物試驗。
二、天然多酚類之抗癌活性研究
近十年來癌症在國人十大死因排行榜中一直名列前矛，科學家們在癌症的研究上也投注相當多的時間與心力，但截至目前為止仍然有許多問題無法克服，例如抗藥性或癌轉移等問題，雖然相較於以往，在面對各種癌症病人的治療時有多種不同的化療藥物可供選擇，但令人困擾的是即使選擇不同的化學治療藥物，一段時間的投予之後經常同樣會出現所謂抗藥性的問題，以至於藥物無法再有效的殺死癌細胞，因此，研發更有效的抗癌藥物或具有癌症預防效果的藥物是重要的研究方向。癌症的發生與暴露於環境中化學性、物理性及病毒性致癌因子 (carcinogens)的量有直接的關係。這些致癌因子會經由基因突變而導致正常細胞癌化。癌症的發生為一多步驟性的致癌過程(multistep carcinogenesis),分成(1)起始期 (initiation phase)為一快速且不可逆的階段，主要由於細胞內的核酸發生突變所致；(2)促進期 (promotion phase)是由於一些致癌原作用，造成基因異常所致；(3)進展期 (progression phase)為癌細胞開始侵犯鄰近正常組織，進而轉移至其他組織或器官。因此能夠在任一時期阻斷癌細胞的進程者，皆為我們尋找天然抗癌藥物的重要目標。
目前在癌症的研究領域上主要分為兩大方向，第一為抗癌能力的研究，在此研究方向主要是以篩選或研發能夠專一性誘導癌細胞進行細胞凋亡(apoptosis)作用，而對正常細胞產生的毒性卻不高的藥物。藉由藥物所誘導的細胞凋亡進而達到殺死癌細胞的作用，比傳統藥物所引發的細胞壞死(necrosis)可在病人體內引起較低的副作用，因為癌細胞透過細胞凋亡的方式死亡後，較不易引發大範圍的週邊組織發炎或感染反應，避免對於病人產生更大的傷害(10, 11)。天然植物多酚類化合物被證實在對正常細胞沒有細胞毒性的藥物濃度下，可以成功的誘導多種癌細胞進行細胞凋亡(12, 13)，我們研究中也發現curcumin，wogonin 與fisetin 等天然化合物能誘導直腸癌細胞與血癌細胞進行細胞凋亡，而其凋亡的機轉主要是透過活細胞內的蛋白酵素caspase 3 與細胞核內的核酸水解酵素所致(Ca+2-dependent DNase) (14)。目前這些在in vitro實驗模型中被證實具有殺死癌細胞的有效成份正著手進行 in vivo 動物實驗來更進一步確定其在動物體內的功效。另一個研究方向主要是針對癌症預防方面，此一研究領域主要是朝向如何利用天然藥物來預防或降低癌症的發生。利用致癌劑12-ο-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)來誘導細胞進行癌化作用，同時觀察天然物對此癌化作用的影響程度是現今常用的化學預防藥物篩選研究模式。TPA本身是很強的細胞癌化促進劑，在動物皮膚試驗及細胞實驗中均證實 TPA 之所以能夠促進細胞癌化是經由活化細胞內的訊息傳導路徑，如蛋白激素之活化(PKC)、致癌基因c-Jun/c-fos之誘導與活化細胞增生的相關酵素如MAPK、JNK等。在癌症的發生與TPA所誘導之癌化作用上，天然多酚類化合物已被證明確實可以有效的抑制癌化作用進行(15, 16)。另外，我們的研究結果也證實天然多酚類如茶多酚(EGCG，TF3)、一些 flavanones的化合物如 flavanone、 2，-OH flavanone、4，-OH flavanone、6-OH flavanone能有效抑制TPA誘導的NIH3T3細胞增生與抑制PKC、c-Jun/c-fos與MAPK之活化。在分析Flavanones 抑制TPA誘導活性結構相關性(structure activity relationship)時發現 2′-OH flavanone為最明顯有效之-OH官能基鍵結位置。接下來，我們將以老鼠表皮癌化模式來證實這些化合物之預防細胞癌化之in vivo 活性。
三、天然多酚類化合物對腦血管之影響
由於人類平均壽命的延長、老年人口的急速增加，因此對於腦血管相關疾病如高血壓、中風等的預防或治療日益重要。由於血腦障壁的結構相當特殊而緊密，一般藥物很難到達，因此開發對腦血管疾病有療效的藥物是刻不容緩的。腦血管的構造可分為內皮細胞層、平滑肌細胞層與外層的結締組織。內皮細胞層與平滑肌細胞層是調控腦血管舒張或縮收之所在。天然多酚類化合物對腦血管之活性目前仍較少研究。為了探討多酚類化合物對腦血管之效用，我們以豬的腦血管當材料，以in vitro tissue bath的方式來探討多酚類化合物對腦血管收縮與舒張之影響。研究結果顯示中藥黃芩萃取物oroxylin A能有效誘導腦血管舒張，其舒張與內皮細胞層存在與否無關。L-arginine 相似物N-nitro-L-arginine(NLA)與N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)前處理並無法抑制oroxylin A所誘導之腦血管舒張，這結果指出NO沒有包含在oroxylin A誘導之腦血管舒張。進一步以一些藥理結抗劑來證實其作用機轉發現當以鉀離子通道阻斷劑如TEA, 4-AP與iberiotoxin前處理時oroxylin A誘導的腦血管舒張能顯著的被抑制。此結果顯示oroxylin A誘導腦血管舒張可能經由活化鉀離子通道所致。因為我們先前已證實oroxylin A 在RAW264.7巨噬細胞中能抑制LPS誘導的誘導型NOS之產生。因此我們進一步探討oroxylin A對LPS誘導之腦血管舒張之影響。一些研究發現LPS能經由活化血管平滑肌細胞中的誘導型NOS而導致血管過度舒張，進而造成血壓過低，最後導致死亡。在我們實驗中發現L-arginine能有效誘導LPS前處理過的腦血管舒張，此舒張作用能被L-arginine相似物NLA與L-NAME有效的抑制。當腦血管前處理在oroxylin A與LPS存在的情形下，L-arginine誘導之腦血管舒張有明顯的被抑制。免疫組織染色法發現LPS處理的腦血管，誘導型NOS在血管的平滑肌細胞層大量表現，oroxylin A能有效抑制其表現(圖一)。我們也同時以組織培養的方法培養腦血管的平滑肌細胞，接著以抗平滑肌細胞b-actin之抗體來確定所培養之平滑肌細胞，結果顯示出95%的細胞為平滑肌細胞。以抗誘導型NOS抗體偵測發現LPS處理能誘導平滑肌細胞內誘導型NOS蛋白大量表現，而oroxylin A能有效抑制誘導型NOS蛋白大量表現 (圖二)。以上結果顯示oroxylin A能有效誘導腦血管舒張，同時，也可抑制LPS誘導腦血管平滑肌細胞誘導型NOS之表現。
綜合我們與一些先前的研究結果證實天然多酚類化合物確實具有很多有利的生物活性，如抗發炎，抗自由基，抗癌與防癌等活性。雖然天然物具有這麼多有效的活性，然而其缺點為有效濃度較高且專一性較差。目前一些研究以將天然多酚類化合物的角色定位於輔佐之用。換言之，就是結合天然多酚類化合物與一些臨床藥物分析其療效。已有報導指出這種處理方式能降低藥物使用劑量、減少抗藥性的產生與使藥物療效加倍。在我們抗發炎研究方面，我們也研究結合L-arginine相似物(NLA與L-NAME)與天然多酚類化合物如wogonin, baicalin 與baicalein來處理LPS誘導之NOS與COX-2之表現。實驗結果顯示wogonin, baicalin 與baicalein能有效抑制NO之產生同時也可以抑制L-arginine相似物(NLA與L-NAME)所刺激之NOS與COX-2表現。老鼠體內實驗來評估結合L-arginine相似物(NLA與L-NAME)與天然多酚類化合物對LPS誘導之影響實驗目前正在進行中。
圖一：以組織免疫螢光染色法偵測Oroxylin A 抑制LPS誘導腦血管之iNOS蛋白表現。(A)對照組；(B)LPS處理腦血管24小時；(C)LPS+Oroxylin A (60 mM)處理腦血管24小時。M代表平滑肌細胞所在；A為結締組織所在
圖二：以免疫螢光染色法偵測Oroxylin A抑制LPS誘導腦血管平滑肌細胞iNOS蛋白之表現。
四、參考文獻
1. Medina I, Satue-Gracia MT, German JB and Frankel EN. (1999) Comparison of natural polyphenol antioxidants from extra virgin olive oil with synthetic antioxidants in tuna lipids during thermal oxidation. J Agr Food Chem 47: 4873-9.
2. Lopes GK, Schulman HM and Hermes-Lima M. (1999) Polyphenol tannic acid inhibits hydroxyl radical formation from fenton reaction by complexing ferrous ions. Biochim Biophys Acta 1472: 142-152.
3. Bellingan G. (1999) Inflammatory cell activation in sepsis. Brit Med Bull 55:12-29.
4. Chen YC, Lin-Shiau SY and Lin JK. (1998) Involvement of reactive oxygen species and caspase 3 activation in arsenite induce apoptosis. J Cell Physiol 177: 324-333.
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http://biometrics.sinica.edu.tw/nsc/article/v15_04/article2.php3
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