Julia Chen

http://www.khjh.kh.edu.tw/science40/%B0%AA%A4%A4/%B0%AA%A4%A4%A4%C6%BE%C71/%BB%A1%A9%FA%AE%D1.htm

 

1.       研究動機

以「油脂的自氧化（Autoxidation） 及抗氧化劑」參加去年全國科展後，認識到油脂的自氧化反應機制，涉及自由基反應，也知道辣椒是一種抗氧化劑，而近來報章雜誌一再談到人體的病變、癌症、老
化等均和人體組織內自由基過量有關，人體保健除了要改善環境品質、減低工作壓力、個人飲食習慣的調整亦非常重要，而且是操之在「我」，不假外求，因此興起 研究天然物質的抗氧化性，以尋找抗氧化性較佳的天然食物，若於日常飲食中多食用，將可減少體內自由基的生成，達到預防保健的目的。

2.       研究目的

本研究之目的，於一般常用食用植物中，尋求具抗氧化性及清除自由基功效者，如此，我們不需要再去購買一些所謂健康食品的植物萃取物，而只要在日常飲食中多加入此類食物，即可由膳食中補充天然抗氧化物，對人體可產生預防保健的功效，而非發病後的治療。

　

以下各項實驗其目的，在於檢驗試樣之抗氧化性及抗氧化機制：還原力、清除自由基、活性氧及螯合亞鐵離子的能力。

1.  
試樣之相對抗氧化活性：以

Na₂S₂O₃滴定油脂中過氧化價（Peroxide Value， POV），比較油脂中過氧化價的變化，並利用線性迴歸法求得相對抗氧化活性。

2.  
試樣之還原力：利用分光光度計測定普魯士藍之生成量，作為檢定試樣還原氧化物的能力。

3.  
試樣清除自由基的能力：以分光光度計偵測

DPPH自由基與試樣反應後吸光值的變化，可檢定試樣提供氫原子，以清除自由基的能力。

4.  
試樣捕捉過氧化氫（

H₂O₂）的能力：利用分光光度計檢測過氧化氫與試樣作用後吸光值的變化，可推定試樣補捉過氧化氫的能力。

5.  
試樣清除超氧陰離子（

superoxide anion）能力：以分光光度計偵測超氧陰離子與試樣反應後吸光值的變化，可檢定試樣清除超氧陰離子的能力。

6.  
試樣螯合亞鐵離子能力：以分光光度計偵測亞鐵離子與抗氧化劑反應生成錯化合物後，吸光值的變化，可檢定試樣螯合亞鐵離子能力。

1.       研究設備器材

1.  
設備器材：

燒杯 錐形瓶 直徑30mm試管

直徑15mm試管 量筒 滴管

數位滴定器 分注器 烘箱

恆溫水槽 微量天平 磁攪拌器

磨粹機 離心機 減壓蒸餾裝置

分光光度計

2.  
藥品：

醋酸 氯仿 硫代硫酸鈉

碘化鉀 澱粉 過氧化氫

Vitamin E 紅辣椒 辣椒素（Capsaicin）

辣椒紅（Capsanthin） 甲醇 赤血鹽

磷酸二氫鈉 磷酸氫二鈉 三氯醋酸

氯化鐵 氯化亞鐵 ferrozine

BHT

a ,a -diphenyl,b -picrylhydrazyl（DPPH）

phenazine methosulphate（PMS） nitroblue tetrazolium（NBT）

dihydromicotineamidadenibe
dinucleotide（NADH）

1.       研究過程或方法

1.  
文獻探討

自由基、活性氧和抗氧化劑這幾個名詞，近年來在報章、雜誌上經常出現，廣受注目的原因是許多研究報導指出，自由基、活性氧在許多疾病﹙如老化、癌症、心血管疾病﹚的發展上扮演極重要的角色。

人體在正常代謝過程中會產生自由基與活性氧，所謂自由基是指帶有一個或多個不成對電子不穩定的物種﹙species﹚，活性氧則為人體代謝產生反應活性較基態氧強的含氧物種；而一些外來的物質如藥物、致癌物及生活壓力在體內代謝過程中也會產生自由基與活性氧，這些物質會進而攻擊細胞膜、細胞組織並危害細胞核內基因物質，再近一步傷害細胞引發病變，甚至死亡。

雖然自由基與活性氧會造成生物體細胞的損害，甚至導致死亡，但在正常狀況下，生物體本身具有抗氧化防禦系統，產生抗氧化酵素及抗氧化物來移除自由基與活性氧，並由修護系統修補所引發的傷害。

本實驗以辣椒來研究其對抗氧化性及清除自由基、活性氧及螯合金屬離子的能力。其研究之架構，即針對圖一、活性氧對生物體的傷害及其防禦系統^（1），進行實驗。

1.  
還原力、光照效應及捕捉過氧化氫（

H₂O₂）能力的檢測，在查證試樣是否具有良好的預防型抗氧化劑功能。

2.  
清除（

DPPH）自由基的能力及清除超氧陰離子能力，表示試樣的自由基清除型抗氧化劑功能的強弱。

3.  
亞鐵離子極易與過氧化氫作用，產生氫氧自由基，促進油脂氧化，進而損害到人體健康，螯合亞鐵離子能力，在查證試樣阻止亞鐵離子與過氧化氫、超氧陰離子作用能力。

1.  
實驗原理

1.  
油脂自氧化反應

一般油脂其主要組成包含：飽和脂肪酸（不帶雙鍵）及不飽和脂肪酸（分子中具有雙鍵構造）的甘油酯；油脂在室溫下與氧結合，引起自氧化反應，此反應，受氧氣分壓、水份、光照、熱、酵素、重金屬離子及抗/助氧化劑之存在，而影響其反應速率；其中不飽和脂肪酸或含不飽和脂肪酸的油脂，隨自氧化反應作用，初期產生過氧化物，然後再分解成揮發性的醛類及酮類，此為油脂酸敗的原因。

1.  
油脂自氧化反應機制

依Farmer等人所題出之「自由基連鎖理論」，說明不飽和油脂自氧化反應機構，其反應機構分為四個基本階段：起始期（Initiation）、連鎖傳導期（Chain
Propagation）、連鎖分支期（Chain Branching）及終止期（Termination）。

                          
i.           
起始期

不飽和油脂雙鍵上的碳氫化合物，受到其他化學活性物質作用，移去氫原子而形成一自由基（free radical），此步驟通常非常緩慢，是此類反應的決定步驟：

（1）RH →R‧ + ‧H

ii.           
連鎖傳導期

此階段的反應含一系列過氧化基及新自由基的生成：

（2）R‧ + O₂
→ ROO‧

（3）ROO‧ +RH → ROOH + R‧

iii.           
連鎖分支期

此階段為過氧化物分解產生新過氧化基及自由基，與傳導期並行，均屬於連鎖反應：

（4）ROOH
→ RO‧ + ‧OH

（5）2ROOH
→ ROO‧ + RO‧ + H₂O

iv.           
終止期

在此反應階段，兩個自由基結合產生非自由基產物而使反應終止：

（6）R‧＋R‧ → RR

（7）R‧＋ROO‧ → ROOR

（8）ROO‧＋ROO‧ → ROOR＋O2

‧

‧

etc.

　

1.  
抗氧化劑

某些物質常添加至食用油中，以減緩油脂自氧化反應之進行，達到保存食用油的目的，此類物質稱為抗氧化劑。一般抗氧化劑（AH）為氫原子供應者（H‧），或自由基接受者，其反應進行如下：

（1）R‧＋AH → RH＋A‧

RO‧＋AH → ROH＋A‧

ROO‧＋AH → ROOH＋A‧

（2）R‧＋A‧ → RA

RO‧＋A‧ → ROA

ROO‧＋A‧ → ROOA

抗氧化劑與自由基作用，產生穩定化合物，自身生成的自由基再與其他自由基結合成穩定化合物，終止自由基之連鎖反應，抑止自氧化反應的進行。

2.  
過氧化價的檢定^（

^2）

油脂中過氧化物，依碘滴定法測定其含量：

ROOH＋2KI → ROH＋I₂＋K₂O

I₂＋澱粉試液 → 藍色

I₂＋2Na₂S₂O₃
→ 2NaI＋Na₂S₄O₆（藍色消失）

1.  
還原力測定^（

^3）

還原力的測定是參考Oyaizu的方法，其原理即試樣將赤血鹽﹙K₃Fe (CN)₆﹚還原成黃血鹽﹙K₄Fe (CN)₆﹚，黃血鹽再與Fe³⁺作用，生成普魯士藍，在700 nm波長測定吸光值，以檢測普魯士藍之生成量，作為試樣的還原力，吸光值愈高，表示試樣還原力愈強。

K₃Fe (CN)₆
+ Sample ¾ ® K₄Fe (CN)₆ + Sample-oxide

3K₄Fe (CN)₆ +4
Fe^{3+ ¾ ®} Fe₄ [Fe (CN)₆]
₃ + 12K⁺

2.  
清除

DPPH自由基能力測定^（3）

參考Shimada的方法，測定清除DPPH自由基的能力，因DPPH是較為安定的自由基，實驗上所採用的 DPPH甲醇溶液為紫蘿蘭色﹙violet﹚在517 nm下有強的吸光值，若與試樣結合，將會降低吸光值，由此藉以判斷試樣清除DPPH自由基的能力，其吸光值愈低，表示試樣清除DPPH自由基的能力愈強。

DPPH‧ + AH
¾ ® DPPH₂ + A‧

Violet decolorized

3.  
捕捉過氧化氫的能力測定^（

^1）

捕捉過氧化氫能力的測定是參考Ruch的方法，其原理為H₂O₂在230
nm波長時有最大吸光值，若與試樣反應，其吸光值將會降低，因此其吸光值愈低，表示試樣捕捉過氧化氫的能力愈強。

4.  
清除超氧陰離子能力測定^（

^3）

參考Robak和Gryglewski的方法，測定清除超氧陰離子的能力，其原理為在非酵素系統中，藉由phenazine methosulphate（PMS）與dihydromicotineamidadenibe
dinucleotide（NADH）作用生成超氧陰離子，再進一步將nitroblue tetrazolium（NBT）還原成藍黑色產物，此化合物在560 nm波長時有最大吸光值，若試樣與超氧陰離子反應，減少藍黑色產物產生，其吸光值將會降低，因此其吸光值愈低，表示試樣清除超氧陰離子的能力愈強。。

5.  
螯合亞鐵離子能力測定^（

^3）

參考Dinis的方法，測定螯合亞鐵離子的能力，實驗原理為在甲醇溶液中，藉ferrozine與Fe²⁺螯合，產生ferrozine-
Fe²⁺錯化合物為鮮紅色，在562 nm下有強的吸光值，若Fe²⁺與試樣結合，減少ferrozine-
Fe²⁺的生成，將會降低吸光值，由此藉以判斷試樣螯合亞鐵離子的能力，其吸光值愈低，表示試樣清螯合亞鐵離子的能力愈強。

1.  
實驗方法

1.  
試樣製備

1.  
將市場採購之新鮮辣椒，分剖成辣椒皮、辣椒肉、辣椒子，置於陽光下曝曬乾燥後，再以研磨機（台中榮聰鐵工廠製）。磨成粉末。

2.  
以微量天平稱樣品

5g，以100
mL正己烷溶劑萃取一次後，經濾紙過濾後之殘渣，再以以100 mL正己烷萃取一次，每次萃取均經24小時攪拌，混合兩次得萃取液，以減壓蒸餾至濃稠狀，重複萃取、減壓蒸餾三~四次，將所得試樣混合收集儲存於冰箱備用。進行實驗前先以甲醇調整試樣萃取物至試驗所需之濃度。

1.  
抗氧化活性測定

1.  
秤紅辣椒及各部分粉末各

1g，分別置於4個燒杯中，且每個燒杯中加入20g大豆油，時時攪拌經一日後，吸取上層萃取液4g，作為試樣。

2.  
將

4g試樣﹙紅辣椒、紅辣椒皮、紅辣椒肉、紅辣椒子﹚分別與大豆油36g混合，置於60℃恆溫水槽進行自氧化反應，每隔一日取樣一次，利用Na₂S₂O₃滴定油脂中過氧化價變化。

﹙若做高溫實驗：則將等量辣椒先經高溫油炸處理處理；做光照實驗：則反應置於暗室。﹚

3.  
滴定方法^（

^3）：

ㄅ、從恆溫水槽或烘箱中取出待測油脂,每種待測油各從微量天枰量取5g至錐形瓶中。

ㄆ、將待測油脂置通風櫥中,先加入25ml已配好的醋酸、氯仿(醋酸：氯仿=3：2
V/V)混合液;再滴入約10滴的飽和碘化鉀溶液。

ㄇ、經一分鐘的攪拌後,倒入25ml的去離子水攪拌均勻後。

ㄈ、以0.01N的硫代硫酸鈉溶液開始滴定至顏色變淡，再加入10滴澱粉液作指示劑，滴定至油脂顏色不再改變為止。

4.  
過氧化價之計算

此處：S=滴定所消耗之硫代硫酸鈉mL數

N=硫代硫酸鈉之當量濃度

W=秤取試樣之重量（g）

*以下試樣均為：BHT、Vitamin
E、辣椒素、辣椒紅、紅辣椒、紅辣椒皮、紅辣椒肉及紅辣椒子

1.  
還原力測定

1.  
取

5mL濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
mg/mL之試樣甲醇溶液，分別加入5mL 0.2M磷酸緩衝溶液（pH
6.6）及1%赤血鹽於50℃水浴中20分鐘。

2.  
將上述溶液取出快速冷卻，加入

10%三氯醋酸5mL，以3000
rpm離心10分鐘，取上層液5mL加入去離子水5mL及0.1%氯化鐵1mL，混合均勻，反應10分鐘。

3.  
以分光光度計，在

700nm波長下，測定其吸光值。

1.