http://www.khjh.kh.edu.tw/science40/%B0%AA%A4%A4/%B0%AA%A4%A4%A4%C6%BE%C71/%BB%A1%A9%FA%AE%D1.htm



 



1.       研究動機



以「油脂的自氧化(Autoxidation) 及抗氧化劑」參加去年全國科展後,認識到油脂的自氧化反應機制,涉及自由基反應,也知道辣椒是一種抗氧化劑,而近來報章雜誌一再談到人體的病變、癌症、老
化等均和人體組織內自由基過量有關,人體保健除了要改善環境品質、減低工作壓力、個人飲食習慣的調整亦非常重要,而且是操之在「我」,不假外求,因此興起 研究天然物質的抗氧化性,以尋找抗氧化性較佳的天然食物,若於日常飲食中多食用,將可減少體內自由基的生成,達到預防保健的目的。



2.       研究目的



本研究之目的,於一般常用食用植物中,尋求具抗氧化性及清除自由基功效者,如此,我們不需要再去購買一些所謂健康食品的植物萃取物,而只要在日常飲食中多加入此類食物,即可由膳食中補充天然抗氧化物,對人體可產生預防保健的功效,而非發病後的治療。



 



以下各項實驗其目的,在於檢驗試樣之抗氧化性抗氧化機制:還原力、清除自由基、活性氧及螯合亞鐵離子的能力。



1.  
試樣之相對抗氧化活性:以



Na2S2O3滴定油脂中過氧化價(Peroxide Value POV),比較油脂中過氧化價的變化,並利用線性迴歸法求得相對抗氧化活性。



2.  
試樣之還原力:利用分光光度計測定普魯士藍之生成量,作為檢定試樣還原氧化物的能力。



3.  
試樣清除自由基的能力:以分光光度計偵測



DPPH自由基與試樣反應後吸光值的變化,可檢定試樣提供氫原子,以清除自由基的能力。



4.  
試樣捕捉過氧化氫(



H2O2)的能力:利用分光光度計檢測過氧化氫與試樣作用後吸光值的變化,可推定試樣補捉過氧化氫的能力。



5.  
試樣清除超氧陰離子(



superoxide anion)能力:以分光光度計偵測超氧陰離子與試樣反應後吸光值的變化,可檢定試樣清除超氧陰離子的能力。



6.  
試樣螯合亞鐵離子能力:以分光光度計偵測亞鐵離子與抗氧化劑反應生成錯化合物後,吸光值的變化,可檢定試樣螯合亞鐵離子能力。



1.       研究設備器材



1.  
設備器材:



燒杯 錐形瓶 直徑30mm試管



直徑15mm試管 量筒 滴管



數位滴定器 分注器 烘箱



恆溫水槽 微量天平 磁攪拌器



磨粹機 離心機 減壓蒸餾裝置



分光光度計



2.  
藥品:



醋酸 氯仿 硫代硫酸鈉



碘化鉀 澱粉 過氧化氫



Vitamin E 紅辣椒 辣椒素(Capsaicin



辣椒紅(Capsanthin 甲醇 赤血鹽



磷酸二氫鈉 磷酸氫二鈉 三氯醋酸



氯化鐵 氯化亞鐵 ferrozine



BHT



a ,a -diphenyl,b -picrylhydrazylDPPH



phenazine methosulphatePMS nitroblue tetrazoliumNBT



dihydromicotineamidadenibe
dinucleotide
NADH



1.       研究過程或方法



1.  
文獻探討



自由基、活性氧和抗氧化劑這幾個名詞,近年來在報章、雜誌上經常出現,廣受注目的原因是許多研究報導指出,自由基、活性氧在許多疾病﹙如老化、癌症、心血管疾病﹚的發展上扮演極重要的角色。



人體在正常代謝過程中會產生自由基活性氧,所謂自由基是指帶有一個或多個不成對電子不穩定的物種﹙species﹚,活性氧則為人體代謝產生反應活性較基態氧強的含氧物種;而一些外來的物質如藥物、致癌物及生活壓力在體內代謝過程中也會產生自由基與活性氧,這些物質會進而攻擊細胞膜、細胞組織並危害細胞核內基因物質,再近一步傷害細胞引發病變,甚至死亡。



雖然自由基與活性氧會造成生物體細胞的損害,甚至導致死亡,但在正常狀況下,生物體本身具有抗氧化防禦系統,產生抗氧化酵素及抗氧化物來移除自由基與活性氧,並由修護系統修補所引發的傷害。



本實驗以辣椒來研究其對抗氧化性及清除自由基、活性氧及螯合金屬離子的能力。其研究之架構,即針對圖一、活性氧對生物體的傷害及其防禦系統1,進行實驗。






1.  
還原力、光照效應及捕捉過氧化氫(



H2O2)能力的檢測,在查證試樣是否具有良好的預防型抗氧化劑功能。



2.  
清除(



DPPH)自由基的能力及清除超氧陰離子能力,表示試樣的自由基清除型抗氧化劑功能的強弱。



3.  
亞鐵離子極易與過氧化氫作用,產生氫氧自由基,促進油脂氧化,進而損害到人體健康,螯合亞鐵離子能力,在查證試樣阻止亞鐵離子與過氧化氫、超氧陰離子作用能力。



1.  
實驗原理



1.  
油脂自氧化反應



一般油脂其主要組成包含:飽和脂肪酸(不帶雙鍵)及不飽和脂肪酸(分子中具有雙鍵構造)的甘油酯;油脂在室溫下與氧結合,引起自氧化反應,此反應,受氧氣分壓、水份、光照、熱、酵素、重金屬離子及抗/助氧化劑之存在,而影響其反應速率;其中不飽和脂肪酸或含不飽和脂肪酸的油脂,隨自氧化反應作用,初期產生過氧化物,然後再分解成揮發性的醛類及酮類,此為油脂酸敗的原因。



1.  
油脂自氧化反應機制



Farmer等人所題出之「自由基連鎖理論」,說明不飽和油脂自氧化反應機構,其反應機構分為四個基本階段:起始期(Initiation連鎖傳導期(Chain
Propagation
連鎖分支期(Chain Branching)及終止期(Termination



                          
i.           
起始期



不飽和油脂雙鍵上的碳氫化合物,受到其他化學活性物質作用,移去氫原子而形成一自由基(free radical),此步驟通常非常緩慢,是此類反應的決定步驟:



1RH R‧ + ‧H



ii.           
連鎖傳導期



此階段的反應含一系列過氧化基及新自由基的生成:



2R‧ + O2
ROO‧



3ROO‧ +RH ROOH + R‧



iii.           
連鎖分支期



此階段為過氧化物分解產生新過氧化基及自由基,與傳導期並行,均屬於連鎖反應:



4ROOH
RO‧ + ‧OH



52ROOH
ROO‧ + RO‧ + H2O



iv.           
終止期



在此反應階段,兩個自由基結合產生非自由基產物而使反應終止:



6R‧R‧ RR



7R‧ROO‧ ROOR



8ROO‧ROO‧ ROORO2







etc.



 



1.  
抗氧化劑



某些物質常添加至食用油中,以減緩油脂自氧化反應之進行,達到保存食用油的目的,此類物質稱為抗氧化劑。一般抗氧化劑(AH)為氫原子供應者(H‧),或自由基接受者,其反應進行如下:



1R‧AH RHA‧



RO‧AH ROHA‧



ROO‧AH ROOHA‧



2R‧A‧ RA



RO‧A‧ ROA



ROO‧A‧ ROOA



抗氧化劑與自由基作用,產生穩定化合物,自身生成的自由基再與其他自由基結合成穩定化合物,終止自由基之連鎖反應,抑止自氧化反應的進行。



2.  
過氧化價的檢定



2



油脂中過氧化物,依碘滴定法測定其含量:



ROOH2KI ROHI2K2O



I2+澱粉試液 藍色



I22Na2S2O3
2NaINa2S4O6(藍色消失)



1.  
還原力測定



3



還原力的測定是參考Oyaizu的方法,其原理即試樣將赤血鹽﹙K3Fe (CN)6﹚還原成黃血鹽﹙K4Fe (CN)6﹚,黃血鹽再與Fe3+作用,生成普魯士藍,在700 nm波長測定吸光值,以檢測普魯士藍之生成量,作為試樣的還原力,吸光值愈高,表示試樣還原力愈強。



K3Fe (CN)6
+ Sample
¾ ® K4Fe (CN)6 + Sample-oxide



3K4Fe (CN)6 +4
Fe3+
¾ ® Fe4 [Fe (CN)6]
3
+ 12K+



2.  
清除



DPPH自由基能力測定3



參考Shimada的方法,測定清除DPPH自由基的能力,因DPPH是較為安定的自由基,實驗上所採用的 DPPH甲醇溶液為紫蘿蘭色﹙violet﹚在517 nm下有強的吸光值,若與試樣結合,將會降低吸光值,由此藉以判斷試樣清除DPPH自由基的能力,其吸光值愈低,表示試樣清除DPPH自由基的能力愈強。



DPPH‧ + AH
¾ ® DPPH2 + A‧



Violet decolorized



3.  
捕捉過氧化氫的能力測定



1



捕捉過氧化氫能力的測定是參考Ruch的方法,其原理為H2O2230
nm
波長時有最大吸光值,若與試樣反應,其吸光值將會降低,因此其吸光值愈低,表示試樣捕捉過氧化氫的能力愈強。



4.  
清除超氧陰離子能力測定



3



參考RobakGryglewski的方法,測定清除超氧陰離子的能力,其原理為在非酵素系統中,藉由phenazine methosulphatePMS)與dihydromicotineamidadenibe
dinucleotide
NADH)作用生成超氧陰離子,再進一步將nitroblue tetrazoliumNBT)還原成藍黑色產物,此化合物在560 nm波長時有最大吸光值,若試樣與超氧陰離子反應,減少藍黑色產物產生,其吸光值將會降低,因此其吸光值愈低,表示試樣清除超氧陰離子的能力愈強。。



5.  
螯合亞鐵離子能力測定



3



參考Dinis的方法,測定螯合亞鐵離子的能力,實驗原理為在甲醇溶液中,藉ferrozineFe2+螯合,產生ferrozine-
Fe2+
錯化合物為鮮紅色,在562 nm下有強的吸光值,若Fe2+與試樣結合,減少ferrozine-
Fe2+
的生成,將會降低吸光值,由此藉以判斷試樣螯合亞鐵離子的能力,其吸光值愈低,表示試樣清螯合亞鐵離子的能力愈強。



1.  
實驗方法



1.  
試樣製備



1.  
將市場採購之新鮮辣椒,分剖成辣椒皮、辣椒肉、辣椒子,置於陽光下曝曬乾燥後,再以研磨機(台中榮聰鐵工廠製)。磨成粉末。



2.  
以微量天平稱樣品



5g,以100
mL
正己烷溶劑萃取一次後,經濾紙過濾後之殘渣,再以以100 mL正己烷萃取一次,每次萃取均經24小時攪拌,混合兩次得萃取液,以減壓蒸餾至濃稠狀,重複萃取、減壓蒸餾三~四次,將所得試樣混合收集儲存於冰箱備用。進行實驗前先以甲醇調整試樣萃取物至試驗所需之濃度。



1.  
抗氧化活性測定



1.  
秤紅辣椒及各部分粉末各



1g,分別置於4個燒杯中,且每個燒杯中加入20g大豆油,時時攪拌經一日後,吸取上層萃取液4g,作為試樣。



2.  



4g試樣﹙紅辣椒、紅辣椒皮、紅辣椒肉、紅辣椒子﹚分別與大豆油36g混合,置於60℃恆溫水槽進行自氧化反應,每隔一日取樣一次,利用Na2S2O3滴定油脂中過氧化價變化。



﹙若做高溫實驗:則將等量辣椒先經高溫油炸處理處理;做光照實驗:則反應置於暗室。﹚



3.  
滴定方法



3



ㄅ、從恆溫水槽或烘箱中取出待測油脂,每種待測油各從微量天枰量取5g至錐形瓶中。



ㄆ、將待測油脂置通風櫥中,先加入25ml已配好的醋酸、氯仿(醋酸:氯仿=32
V/V)
混合液;再滴入約10滴的飽和碘化鉀溶液。



ㄇ、經一分鐘的攪拌後,倒入25ml的去離子水攪拌均勻後。



ㄈ、以0.01N的硫代硫酸鈉溶液開始滴定至顏色變淡,再加入10滴澱粉液作指示劑,滴定至油脂顏色不再改變為止。



4.  
過氧化價之計算





此處:S=滴定所消耗之硫代硫酸鈉mL



N=硫代硫酸鈉之當量濃度



W=秤取試樣之重量(g



*以下試樣均為:BHTVitamin
E
、辣椒素、辣椒紅、紅辣椒、紅辣椒皮、紅辣椒肉及紅辣椒子



1.  
還原力測定



1.  



5mL濃度分別為0.20.40.60.81.0
mg/mL
之試樣甲醇溶液,分別加入5mL 0.2M磷酸緩衝溶液(pH
6.6
)及1%赤血鹽於50℃水浴中20分鐘。



2.  
將上述溶液取出快速冷卻,加入



10%三氯醋酸5mL,以3000
rpm
離心10分鐘,取上層液5mL加入去離子水5mL0.1%氯化鐵1mL,混合均勻,反應10分鐘。



3.  
以分光光度計,在



700nm波長下,測定其吸光值。



1.  

創作者介紹
創作者 juliachanhk2002 的頭像
juliachanhk2002

Julia Chen

juliachanhk2002 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()