一、 研究動機



魚類的生產對於台灣經濟及食物的供應都相當重要,近年來,高經濟價值的海水魚在台灣養殖漁業中,更是佔有十分重要的地位。然而自一九九二年澎湖爆發Iridovirus﹙虹彩病毒﹚這種病毒疾病以來,屢屢造成海水魚類的死亡,受感染的魚會有貧血的症狀,導致嚴重的經濟損失,這種傳染性的疾病對於海水魚的養殖造成十分嚴重的傷害,1995年在台灣南部的石斑魚場有高達60
%死亡率的急性病例報告出現。   



然而自爆發至今,我們尚不能有效控制虹彩病毒,對於此病毒的基本特性也了解不多,而病毒蛋白質的合成在病毒複製的過程中相當的重要,等於間接觀察病毒基因的表現,可藉由此一機制的解密,進而發現病毒蛋白質的作用及對病毒複製過程的影響,有助於了解病毒複製繁殖的機制,在發展上更可以利用其蛋白當作抗原來作免疫反應產生抗體,以為將來的疫苗研發奠基,達到控制這種病毒的目的。



 



二、 研究目的



  我們針對虹彩病毒的致病效應,及病毒蛋白質的特性作以下的觀察研究:



﹙1﹚          
觀察虹彩病毒對Fin細胞株的細胞致病效應﹙cytopathic effects,CPE現象﹚。



﹙2﹚          
找出虹彩病毒的蛋白質﹙包含capsid proteins、envelope     
proteins、viral proteins﹚有哪些?



﹙3﹚          
這些病毒蛋白質在病毒複製的過程中合成的時序。



﹙4﹚          
追蹤病毒蛋白質合成過程中的切割作用。



 



三、 實驗器材



(1)    
實驗材料:



Grouper Fin (GF) cell line,以石斑魚的鰭部組織取得的細胞作成,以這種細胞作為培養病毒的寄主細胞。



Grouper Iridovirus of Taiwan (TGIV)



(2)    
實驗器材:











無菌操作台



倒立式光學顯微鏡



Flask(細胞培養瓶)



96 well plate



petri dish



離心管



超高速離心機



電泳槽



轉漬槽











(3)    
實驗藥品:











PBS



L-15 medium



Trypsin-EDTA



PEG



TNE buffer



CsCl



Separating gel



Stacking gel



Coomassie blue



Destain









 



四、 研究過程或方法



首先我們先從掌握Fin細胞株的特性做起:



實驗步驟:



(1)             
細胞培養。



   將Fin細胞培養於L-15 medium中,根據觀察,Fin的生長速度約2~3天即達monolayer﹙細胞長滿整個用來培養的Flask,但卻不堆疊成數層,而是單層的佈滿,此時為細胞之最佳狀態﹚,若等到其堆疊起來,那麼細胞就老化了,很多生理現象都有變化,故往後我們用來培養病毒的細胞都控制在monolayer的狀態。



(2)             
繼代培養Passage。



   monolayer的細胞必須先把舊的medium倒掉



    
→PBS wash﹙清除死細胞及代謝廢物﹚



   →加Trypsin-EDTA﹙使附著在培養瓶底的細胞層脫落﹚



    
→加新鮮的培養基L-15﹙含trypsin inhibitor,終止   



    
trypsin作用﹚



    
→Passage:一瓶變兩瓶或三瓶﹙給細胞更多的生存空間﹚



(3)             
感染病毒。



  
倒掉medium



→加入病毒液,並shake一小時,使病毒充分seeding到細



胞上



→加medium



→觀察細胞型態的改變



 



   
接著我們想要探討虹彩病毒的蛋白質有哪些,我們先放大並純化出病毒,然後以SDS-PAGE電泳分析病毒的蛋白質有哪些。



實驗步驟:    



(1)   
細胞繼代培養。



(2)   
病毒力價測定。



    以TCID50的方法,分別用十種不同濃度的病毒液﹙10-1、10-2、10-3…10-10﹚感染Fin細胞,觀察第3~7天的CPE現象,來計算病毒的數目﹙PFU/ml﹚。



(3)   
病毒增殖放大。



    以Fin為寄主細胞,將M.O.I=0.1~0.01﹙PFU/cell﹚的虹彩病毒感染Fin,觀察CPE,當CPE達九成以上時回收病毒液,離心取上清液,存於4℃。



(4)   
病毒純化。



    將收集好的病毒液離心,把細胞碎片離掉﹙8000rpm,4℃,10min﹚



     →取上清液加入2.2 % NaCl及7 % PEG,以形成網狀結構將virus抓住



     →離心﹙10Krpm,4℃,1hr﹚把網狀結構連同virus離下來,並以TNE
buffer將pellet 溶出



    →超高速氯化銫濃度梯度離心分層。將20 %、30 %、40 %之CsCl溶於TNE
buffer,再依序將40 % 4ml,30 % 3ml,20 % 2ml的CsCl及病毒液3~4ml加入13ml之離心管中離心﹙35Krpm,4℃,17hr﹚



    →取浮力密度在1.15~1.35 g/cm3的band,即為純化之



    Iridovirus。



(5)   
SDS-PAGE。



Install electrophoresis equipment



Making 10 % separating gel and 3 % stacking
gel



sample protein濃度定量﹙測吸光值﹚



→加sample buffer﹙SDS使蛋白質變性,並在分子表面均勻佈上一層負電荷,使所有的蛋白質都往正極跑﹚



Load marker and sample virus into the well
and put in running buffer



→電泳80V for 20~30 min﹙stacking gel﹚;100~120V
for 2~3 hours﹙separating gel﹚



Coomassie blue 染色



Destain退染



→封膠觀察分析。



 



我們接著要探討的問題是:病毒蛋白質在病毒複製的過程中合成的時序。針對這個問題,我們在病毒感染後一序列的時刻收sample,進行Western blotting,用已製備之抗體對病毒蛋白質作專一性結合呈色。



實驗步驟:



(1)             
培養Fin細胞於直徑6 cm 之petri dish,待其monolayer之後攻入high M.O.I的virus﹙100PFU/ml﹚。



(2)             
兩個小時後除去病毒液,加入不含血清之維持培養液,incubate at 28℃。



(3)             
Time
course。



以兩小時為間隔,在攻毒後0小時、2小時、4小時、6小時……以sample buffer
lysis細胞,打斷病毒複製的circle,收取該時刻之蛋白質sample。



(4)             
SDS-PAGE



(5)             
Western
blotting。



在轉漬槽中將gel放負極端,membrane 放正極端,把    



proteins transfer 到消化纖維﹙nitrocellulose﹚
membrane 上,因為蛋白質經SDS sample buffer處理過後全都帶負電,在轉漬槽中會朝向正極移動到membrane 上﹙Under 400
mA for 1 hour at 4℃﹚



Blocking membrane with 5 % nonfat milk, 以milk中之蛋白質binding
membrane 上沒有轉印到蛋白質的sites,以降低background



→抗體免疫染色,用已製備之抗體對membrane上之蛋白質抗原作專一性結合



→二級抗體顯影呈色。



 



最後我們想探討的問題是病毒蛋白質合成過程中的切割作用。我們以S35Methionine
label病毒蛋白,在不同時刻研究其蛋白質的切割。藉由此種方法的比對,尚可同時發現一些不存在於病毒顆粒中,但為病毒在寄主細胞中製造出的蛋白質,而該蛋白質只負責病毒在細胞中複製過程的相關功能,病毒複製完要budding
out之時並不會一起組裝到病毒顆粒中,這是以純化之病毒作SDS-PAGE所無法看到的。﹙Methionine:蛋胺酸﹚



實驗步驟:



(1) 培養Fin細胞於petri dish,待其monolayer之後攻入high
M.O.I的virus,然後以不含Methionine之培養液培養﹙starving﹚,一段時間後選定一個特定時刻,例如攻毒後第十七到第十九個小時(視蛋白質合成時序結果而定),將培養液換為含有被S35標記之Methionine的medium﹙Hot﹚,去label這段期間做出來的蛋白質。之後再換回不含Methionine的培養液﹙Cold﹚。



(2) Time course。



以一小時為間隔,在更換S35Methionine medium 後第零小時、第一小時、第二小時……以sample
buffer lysis細胞,收取蛋白質sample。



(3) SDS-PAGE



同位素螢光呈色。



 



五、 實驗結果



實驗進行到十一月底,已經完成前兩部分的觀察與研究,以下為第一部份:細胞病變效應的觀察,及第二部分:探討病毒蛋白質有哪些的實驗結果。



(1)             
根據觀察結果,比較加病毒液和不加病毒液的細胞,發現虹彩病毒對Fin所造成的CPE現象為使病變細胞變圓﹙rounding﹚、空泡、及形成巨大細胞﹙giant
cell﹚。﹙附錄三圖1~4﹚



(2)             
純化出的虹彩病毒以SDS-PAGE分析,顯現在gel上的band較明顯且表現穩定的有至少五種主要的蛋白質,根據在SDS-PAGE上蛋白質量的多寡﹙看band的濃度﹚,已確認其主要的殼蛋白﹙Major
Capsid Protein﹚分子量在48KDa;另有其他四種明顯的蛋白質:VP1分子量為68KDa;VP2分子量為60KDa;VP3分子量為39KDa;VP4分子量為23KDa。﹙附錄二﹚。



  接著尚未完成的兩個部分的實驗會持續的進行下去,我將依照實驗設計持續研究虹彩病毒蛋白質的特性,並逐一把合成的機制解開,以作為更進一步探究該病毒蛋白質的基石,以期發現病毒蛋白質的作用及對病毒複製過程的影響,有助於了解病毒複製的機制,為將來的疫苗研發奠基,而達到控制這種病毒的目的。



 



六、  
討論



(1)             
CPE現象中,原本飽滿而略為細長的Fin細胞會整個變圓﹙rounding﹚,細胞縮起來而不延伸,不延伸就不能生長繁殖,這個細胞就會被慢慢淘汰掉。另外,巨大細胞﹙giant
cell﹚在顯微鏡下看起來比正常細胞大,可能是數個細胞核融合而成。而空泡的現象是因為細胞的新陳代謝受到阻礙,細胞吸入大量的水,而在細胞質顯現空泡的症狀。



(2)             
虹彩病毒是正二十面體有套膜病毒,其蛋白質大部分集中在其二十面的外殼﹙capsid﹚上,其中有一個量最多表現最明顯的MCP(Major Capsid Protein),其分子量為48Kda,整個但外殼幾乎都是由這個蛋白質架構出來的,另外還有一些蛋白質在外套膜﹙envelope﹚上,推測應該多為脂蛋白﹙lipoprotein﹚,因為envolope是在該病毒要從細胞中budding
out時來自寄主細胞膜的,但含量不多;由前人所作的電顯圖中我們可以很清楚的看到在envelope上還有棘(spike),spike一般來說多為醣蛋白,可以和有感受性之寄主細胞的recepter專一結合而感染侵入細胞;另有一些viral
proteins和DNA一起被capsid包在裡面,這些蛋白質通常扮演著酵素的角色,我們猜測很有可能為DNA轉錄脢。



 



七、結論



虹彩病毒對Fin所造成的CPE現象為使病變細胞變圓﹙rounding﹚、空泡、及形成巨大細胞﹙giant
cell﹚。



  虹彩病毒之蛋白質有:Major Capsid Protein分子量為48Kda;VP1分子量為68KDa;VP2分子量為60KDa;VP3分子量為39KDa;VP4分子量為23Kda等五種。



 



八、參考資料及其他



1)H. Y. Chou, C.
C. Hsu and T. Y. Peng (1998): Isolation and characterization of a pathogenic
iridovirus from cultured grouper (Epinphelus sp) in
taiwan. Fish Pathology. 33 (4), 201-206.



2)Jinghe Mao,D.E
Green,G.Fellers,V.G. Chinchar(1999):Molecular characterization of iridovirus
isolated from sympatric amphibians and fish.Virus Research 63,45-52



3)現代病毒學大綱 張信之著
藝軒出版



4﹚漁情報導



附錄一:Iridovirus簡介



Iridovirus屬於Iridoviridae﹙虹彩病毒科﹚,目前共分為五個屬,依寄主分為兩類:非脊椎動物﹙Cglorirdovirus等﹚和脊椎動物﹙Iridovirus、Ranavirus、Lymphocystivirus等﹚,寄生範圍相當廣泛,從非脊椎動物的昆蟲及甲殼類到脊椎動物的魚類、兩生類、爬蟲類等,且世界各地均有分布,包含澳洲、北美、南美、歐洲、東北亞等,影響深遠。



    本實驗以台灣分離出之Grouper
Iridovirus of Taiwan (TGIV) 為研究對象,此病毒顆粒為正二十面體﹙icosahedron﹚,有套膜﹙envelope﹚,大小約為230nm,其遺傳物質為雙股DNA,且DNA甲基化程度高達80
%,故其DNA不容易被酵素破壞。其物理或化學性質中,相關文獻報告Iridovirus可被乙醚﹙Ether﹚及有機溶劑如氯仿﹙Chloroform﹚去活性;在pH=11的強鹼環境中亦保有很高的病毒力價,但在pH=3的強酸中病毒力價則是降低的﹙H.
Y.Chou,C.C.Hsu and T.Y.Peng,1998﹚。



  Iridovirus主要侵犯魚類之造血組織,造成魚類鰓部出血腫大,脾臟肥大褪色,鰭、體表有黑點,其他臟器如心臟、肝、卵巢、腸等都可能被波及,急性感染對於較幼小的魚隻甚至造成100
%的死亡率。會在寄主細胞質產生包含體﹙inclusion bodies﹚。傳染途徑為經由鰓及體表水平傳染,最佳發育溫度在25~28℃,在1994及1995年夏季水溫異常增高時,尤其加重疫情。

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