Julia Chen

四、 研究過程或方法

首先我們先從掌握Fin細胞株的特性做起：

實驗步驟：

(1)             
細胞培養。

   將Fin細胞培養於L-15 medium中，根據觀察，Fin的生長速度約2~3天即達monolayer﹙細胞長滿整個用來培養的Flask，但卻不堆疊成數層，而是單層的佈滿，此時為細胞之最佳狀態﹚，若等到其堆疊起來，那麼細胞就老化了，很多生理現象都有變化，故往後我們用來培養病毒的細胞都控制在monolayer的狀態。

(2)             
繼代培養Passage。

   ｍonolayer的細胞必須先把舊的medium倒掉

    
→PBS wash﹙清除死細胞及代謝廢物﹚

　　 →加Trypsin-EDTA﹙使附著在培養瓶底的細胞層脫落﹚

    
→加新鮮的培養基L-15﹙含trypsin inhibitor，終止   

    
trypsin作用﹚

    
→Passage：一瓶變兩瓶或三瓶﹙給細胞更多的生存空間﹚

(3)             
感染病毒。

  
倒掉medium

→加入病毒液,並shake一小時,使病毒充分seeding到細

胞上

→加medium

→觀察細胞型態的改變

   
接著我們想要探討虹彩病毒的蛋白質有哪些，我們先放大並純化出病毒，然後以SDS-PAGE電泳分析病毒的蛋白質有哪些。

實驗步驟：    

(1)   
細胞繼代培養。

(2)   
病毒力價測定。

    以TCID₅₀的方法，分別用十種不同濃度的病毒液﹙10^-1、10^-2、10^-3…10^-10﹚感染Fin細胞，觀察第3~7天的CPE現象，來計算病毒的數目﹙PFU/ml﹚。

(3)   
病毒增殖放大。

    以Fin為寄主細胞，將M.O.I=0.1~0.01﹙PFU/cell﹚的虹彩病毒感染Fin，觀察CPE，當CPE達九成以上時回收病毒液，離心取上清液，存於4℃。

(4)   
病毒純化。

    將收集好的病毒液離心，把細胞碎片離掉﹙8000rpm，4℃，10min﹚

     →取上清液加入2.2 % NaCl及7 % PEG，以形成網狀結構將virus抓住

     →離心﹙10Krpm，4℃，1hr﹚把網狀結構連同virus離下來，並以TNE
buffer將pellet 溶出

    →超高速氯化銫濃度梯度離心分層。將20 %、30 %、40 %之CsCl溶於TNE
buffer，再依序將40 % 4ml，30 % 3ml，20 % 2ml的CsCl及病毒液3~4ml加入13ml之離心管中離心﹙35Krpm，4℃，17hr﹚

    →取浮力密度在1.15~1.35 g/cm³的band，即為純化之

    Iridovirus。

(5)   
SDS-PAGE。

Install electrophoresis equipment

→Making 10 % separating gel and 3 % stacking
gel

→sample protein濃度定量﹙測吸光值﹚

→加sample buffer﹙SDS使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷，使所有的蛋白質都往正極跑﹚

→Load marker and sample virus into the well
and put in running buffer

→電泳80V for 20~30 min﹙stacking gel﹚；100~120V
for 2~3 hours﹙separating gel﹚

→Coomassie blue 染色

→Destain退染

→封膠觀察分析。

我們接著要探討的問題是：病毒蛋白質在病毒複製的過程中合成的時序。針對這個問題，我們在病毒感染後一序列的時刻收sample，進行Western blotting，用已製備之抗體對病毒蛋白質作專一性結合呈色。

實驗步驟：

(1)             
培養Fin細胞於直徑6 cm 之petri dish，待其monolayer之後攻入high M.O.I的virus﹙100PFU/ml﹚。

(2)             
兩個小時後除去病毒液，加入不含血清之維持培養液，incubate at 28℃。

(3)             
Time
course。

以兩小時為間隔，在攻毒後0小時、2小時、4小時、6小時……以sample buffer
lysis細胞，打斷病毒複製的circle，收取該時刻之蛋白質sample。

(4)             
SDS-PAGE

(5)             
Western
blotting。

在轉漬槽中將gel放負極端，membrane 放正極端，把    

proteins transfer 到消化纖維﹙nitrocellulose﹚
membrane 上，因為蛋白質經SDS sample buffer處理過後全都帶負電，在轉漬槽中會朝向正極移動到membrane 上﹙Under 400
mA for 1 hour at 4℃﹚

→Blocking membrane with 5 % nonfat milk， 以milk中之蛋白質binding
membrane 上沒有轉印到蛋白質的sites，以降低background

→抗體免疫染色，用已製備之抗體對membrane上之蛋白質抗原作專一性結合

→二級抗體顯影呈色。

最後我們想探討的問題是病毒蛋白質合成過程中的切割作用。我們以S³⁵Methionine
label病毒蛋白，在不同時刻研究其蛋白質的切割。藉由此種方法的比對，尚可同時發現一些不存在於病毒顆粒中，但為病毒在寄主細胞中製造出的蛋白質，而該蛋白質只負責病毒在細胞中複製過程的相關功能，病毒複製完要budding
out之時並不會一起組裝到病毒顆粒中，這是以純化之病毒作SDS-PAGE所無法看到的。﹙Methionine：蛋胺酸﹚

實驗步驟：

(1) 培養Fin細胞於petri dish，待其monolayer之後攻入high
M.O.I的virus，然後以不含Methionine之培養液培養﹙starving﹚，一段時間後選定一個特定時刻，例如攻毒後第十七到第十九個小時（視蛋白質合成時序結果而定），將培養液換為含有被S³⁵標記之Methionine的medium﹙Hot﹚，去label這段期間做出來的蛋白質。之後再換回不含Methionine的培養液﹙Cold﹚。

(2) Time course。

以一小時為間隔，在更換S³⁵Methionine medium 後第零小時、第一小時、第二小時……以sample
buffer lysis細胞，收取蛋白質sample。

(3) SDS-PAGE

同位素螢光呈色。

五、 實驗結果

實驗進行到十一月底，已經完成前兩部分的觀察與研究，以下為第一部份：細胞病變效應的觀察，及第二部分：探討病毒蛋白質有哪些的實驗結果。

(1)             
根據觀察結果,比較加病毒液和不加病毒液的細胞,發現虹彩病毒對Fin所造成的CPE現象為使病變細胞變圓﹙rounding﹚、空泡、及形成巨大細胞﹙giant
cell﹚。﹙附錄三圖1~4﹚。

(2)             
純化出的虹彩病毒以SDS-PAGE分析，顯現在gel上的band較明顯且表現穩定的有至少五種主要的蛋白質，根據在SDS-PAGE上蛋白質量的多寡﹙看band的濃度﹚，已確認其主要的殼蛋白﹙Major
Capsid Protein﹚分子量在48KDa；另有其他四種明顯的蛋白質：VP1分子量為68KDa；VP2分子量為60KDa；VP3分子量為39KDa；VP4分子量為23KDa。﹙附錄二﹚。

　　接著尚未完成的兩個部分的實驗會持續的進行下去，我將依照實驗設計持續研究虹彩病毒蛋白質的特性，並逐一把合成的機制解開，以作為更進一步探究該病毒蛋白質的基石，以期發現病毒蛋白質的作用及對病毒複製過程的影響，有助於了解病毒複製的機制，為將來的疫苗研發奠基，而達到控制這種病毒的目的。

六、  
討論

(1)             
CPE現象中，原本飽滿而略為細長的Fin細胞會整個變圓﹙rounding﹚，細胞縮起來而不延伸，不延伸就不能生長繁殖，這個細胞就會被慢慢淘汰掉。另外，巨大細胞﹙giant
cell﹚在顯微鏡下看起來比正常細胞大，可能是數個細胞核融合而成。而空泡的現象是因為細胞的新陳代謝受到阻礙，細胞吸入大量的水，而在細胞質顯現空泡的症狀。

(2)             
虹彩病毒是正二十面體有套膜病毒，其蛋白質大部分集中在其二十面的外殼﹙capsid﹚上，其中有一個量最多表現最明顯的MCP（Major Capsid Protein），其分子量為48Kda，整個但外殼幾乎都是由這個蛋白質架構出來的，另外還有一些蛋白質在外套膜﹙envelope﹚上，推測應該多為脂蛋白﹙lipoprotein﹚，因為envolope是在該病毒要從細胞中budding
out時來自寄主細胞膜的，但含量不多；由前人所作的電顯圖中我們可以很清楚的看到在envelope上還有棘（spike），spike一般來說多為醣蛋白，可以和有感受性之寄主細胞的recepter專一結合而感染侵入細胞；另有一些viral
proteins和DNA一起被capsid包在裡面，這些蛋白質通常扮演著酵素的角色，我們猜測很有可能為DNA轉錄脢。

七、結論

虹彩病毒對Fin所造成的CPE現象為使病變細胞變圓﹙rounding﹚、空泡、及形成巨大細胞﹙giant
cell﹚。

　　虹彩病毒之蛋白質有：Major Capsid Protein分子量為48Kda；VP1分子量為68KDa；VP2分子量為60KDa；VP3分子量為39KDa；VP4分子量為23Kda等五種。

八、參考資料及其他

（1）H. Y. Chou, C.
C. Hsu and T. Y. Peng (1998): Isolation and characterization of a pathogenic
iridovirus from cultured grouper (Epinphelus sp) in taiwan. Fish Pathology. 33 (4), 201-206.

（2）Jinghe Mao，D.E
Green，G.Fellers，V.G. Chinchar（1999）：Molecular characterization of iridovirus
isolated from sympatric amphibians and fish.Virus Research 63,45-52

（3）現代病毒學大綱　張信之著
藝軒出版

﹙4﹚漁情報導

附錄一：Iridovirus簡介

Iridovirus屬於Iridoviridae﹙虹彩病毒科﹚，目前共分為五個屬，依寄主分為兩類：非脊椎動物﹙Cglorirdovirus等﹚和脊椎動物﹙Iridovirus、Ranavirus、Lymphocystivirus等﹚，寄生範圍相當廣泛，從非脊椎動物的昆蟲及甲殼類到脊椎動物的魚類、兩生類、爬蟲類等，且世界各地均有分布，包含澳洲、北美、南美、歐洲、東北亞等，影響深遠。

    本實驗以台灣分離出之Grouper
Iridovirus of Taiwan (TGIV) 為研究對象，此病毒顆粒為正二十面體﹙icosahedron﹚，有套膜﹙envelope﹚，大小約為230nm，其遺傳物質為雙股DNA，且DNA甲基化程度高達80
%，故其DNA不容易被酵素破壞。其物理或化學性質中，相關文獻報告Iridovirus可被乙醚﹙Ether﹚及有機溶劑如氯仿﹙Chloroform﹚去活性；在pH=11的強鹼環境中亦保有很高的病毒力價，但在pH=3的強酸中病毒力價則是降低的﹙H.
Y.Chou，C.C.Hsu and T.Y.Peng，1998﹚。

  Iridovirus主要侵犯魚類之造血組織，造成魚類鰓部出血腫大，脾臟肥大褪色，鰭、體表有黑點，其他臟器如心臟、肝、卵巢、腸等都可能被波及，急性感染對於較幼小的魚隻甚至造成100
%的死亡率。會在寄主細胞質產生包含體﹙inclusion bodies﹚。傳染途徑為經由鰓及體表水平傳染，最佳發育溫度在25~28℃，在1994及1995年夏季水溫異常增高時，尤其加重疫情。