篇名



基因治療之發展與演進之研究與探討



 



 



 



 



 



作者



吳岳勳。國立台中第一高級中學。二年八班.



陳建銘。國立台中第一高級中學。二年八班.



曾建豪。國立台中第一高級中學。二年八班.



 



 



 



 



 



 



 



 



 



 



 



●前言



 



我們在搜尋主題過程中,主要是以現今所學之細胞應用為主軸搜尋,加上英文課本裡提到現在相當流行的基因工程,便在圖書館裡發現這個主題,基因治療是個說比做更容易的技術,且未來具有相當的發展空間,便決定挑選這個主題.



                   



翻閱人類醫藥發展史中,主要存在著三個相當大的飛躍性進步.(1)當社會開始採取公共衛生措施來建立衛生制度時,大多人才能免於毀滅性的感染.(2)能夠用麻醉來進行外科手術,使醫生能夠真正的治療某些特定疾病(例如:當某人得到闌尾炎,必須將闌尾切除才能治癒.).(3)疫苗和抗生素的出現,使得許多微生物所傳染的疾病得到預防及醫治.



然而在二十一世紀的今天,基因療法即將創造第四次的醫藥革命,因為把正常經人類挑選的基因藉由某種管道給病人的細胞,許多疾病就能有可能治癒或緩解,包括許多迄今仍無法完全治癒的絕大多數病症。總觀來看,幾乎每種疾病都看成是部分歸因於一個或多個基因,不能正常履行其功能所致。基因產生蛋白質(細胞的主要工作者),而缺失基因當其誘使細胞製造出的蛋白質數量有問題或形態異常時, 它們就能使人體得病。 大約有4,000種疾病,如嚴重複合免疫缺損症(SCID)和囊性纖維變性(cysticfibrosis),是由於單基因受到先天性的傷害所致。



而許多其它的疾病--例如,使人痛苦的癌症、心臟病、愛滋病(AIDS)、關節炎 (arthriti)和衰老(senility)在一定程度上都產生於與人體防禦系統有關的一個或多個基因受到損傷。這些防禦系統全部在遺傳上都具有特異性的蛋白質,它們不僅涉及免疫系統,而且也涉及人體的自我運轉機構。例如,肝細胞製造的蛋白質,就有助於從血液中清除膽固醇(cholesterol)。如果肝細胞製造蛋白質的基因出了毛病,就會導致這種蛋白質的劑量或有效性下降,其結果就可能升高膽固醇水平,出現動脈粥樣硬化
(atherosclerosis),甚至誘發心臟病。



 



●正文





.基因治療是什麼



時代的演進,現代醫療不再只是使用化學藥物來治療病患,而是採納更進步的基因治療。所謂基因治療(gene therapy)是利用分子生物學中的DNA(去氧核醣核酸)重組(DNA recombination)以及基因的轉殖技術,將重組的DNA分子或片段傳遞至一人或多人的人體染色體內,將患者有遺傳性、新陳代謝或癌症等疾病細胞內的基因加以重組或是置換,使其恢復正常功能。或者是在已經喪失功能的基因外,輸入額外的正常基因,以求增加更多的產物,讓病換得以恢復健康的新進現代醫療科技。而DNA重組技術就是基因治療的基本技術,重組DNA意思是在活體細胞外,將自然存在或是人工合成的DNA分子片段接到其他片段之上,且將此形成的分子組合送入活的細胞,這種還是可以隨著細胞繼續增殖。



 



.基因治療的歷史



隨著遺傳工程技術的迅速發展,人們為了解決長久以來難以處理的醫療問題,在1960到1970年間,全球對產生變性的病毒有進一步的了解,開始有人嘗試以此做一個載體將外來基因送入一個特定的細胞內。而大約在1984年左右,美國醫學界曾經提議要做基因治療,而且有些技術已達到臨床實驗階段,但卻因人權的考量,爭論了五六年以後,社會、宗教、法律等各界才擁有用體細胞來做基因治療的共識,並且限定只能在其他治療方法完全無效時,才能施打基因治療。到現在世界各國皆不允許人類進行人體複製,我國亦然。從1990年第一例治療開始,在短短十幾年間,已經治療了許多無助的病人,到現在,甚至已經開始進行幹細胞的移植,不過這種違反自然法則的技術,是否會遭到不可避免的懲罰,是否會產生另一種類似愛滋病病毒?這些都是在進行基因治療的工程師直得深思的地方。



 



.基因轉殖的方法



A.病毒載體



 



01.反轉錄病毒載體(Retroviral
Vector)



 



這是目前使用最多的方法,他是帶有鞘膜(envelop)的RNA病毒。其可經由反轉路酵素作用形成雙股螺旋DNA,在嵌插在宿主染色體中,達到基因轉殖及持續性表現的特性。此類型病毒使用須顧慮嵌插造成的突變(insertional
mutagenesis)及造成可複製能力的野生種病毒(replication competent virus , RCV)產生等等問題,若是在Packaging
Cell Line內發生重組,會導致野生型RCV的產生,則會使嵌插所造成的突變機率變大。



 



 



 



02.腺病毒載體(Adenoviral
Vector):



 



這是一個相當大的DNA病毒。當作為載體之用時,病毒基因體上之E1及E3均已被剔除。E1剔除是使重組腺病毒將來在標的細胞內不具有複製能力。E3b剔除則是增加載體承受外來基因的空間,因為E3對病毒是不重要的。使用載體的方法,乃是利用同源基因重組,將基因表現部份的質體與絕大部份的病毒基因體同時送入293細胞,經過重組後,再由其所提供的E1基因來複製重組病毒。而重組病毒則可用去感染標的細胞。腺病毒的力價一般非常高,且病毒穩定,所以常可用來直接invivo轉殖。腺病毒的感染,並不要求細胞的分裂這些都是它住於反轉錄病毒之處。但相對的,腺病毒不嵌插在細胞染色體中,又不會在細胞內複製,故它的表現是屬短暫性的,在一段時後,若經細胞分裂,病毒DNA可能就消失掉,表現亦告中止。同時,腺病毒載體在體帣的表現會造成非常嚴重的免疫反應,有cellular
immunity而來,也有由humoral immunity而來,這也是造成帶有腺病毒載體的標的細胞在體內很快就會被消滅的原因之一。故而若想重複注射腺病毒載體來進徑基因治療基本上是行不通的。使狦腺病毒載體最大的安全性顧慮,就是會有RCV的產生,欲是因為細胞內可能有類似E1的蛋白質存在,可提供重組病毒進一步的複製、繁殖及傳播,故第二代的病毒載體偩有必要針對此點加以改善。



 



03.
Adenovirus-associated virus腺相關病毒載體



 



腺相關病毒則是另一種可將基因嵌入染色體的病毒,此病毒本身並不會造成病症,因此相對安全,但在製造此病毒時,須要利用腺病毒提供必要的蛋白質,因此在製造腺相關病毒後,須確保裡面並不含有腺病毒才不會造成不必要的副作用;此外,腺相關病毒本身非常小,因此所能攜帶的目標基因大小只能到3.5~4千個鹼基對,因而限制了它的用途。



 



04. 皰疹病毒載體



 



皰疹病毒作為載體,因為這類病毒在中樞神經細胞內可提供一長玥、持續的表現,故或許可用來治療一些與中樞神經有關的疾病。然而這類病毒的基因體太大、太複雜,如何做到一個完全失去複製能力之重組病毒是非常困難。即使其不具複製能力,經過重組病毒感染的細胞,因為表現太多皰疹病毒基因產物之故,也常常成為細胞內免疫系統攻擊的對象



 



 



 



B.非病毒載體



 



05. 微脂粒法之基因轉殖



 



磷脂質是同時帶有親水與疏水性質的分子,當磷脂質濃度夠高時其疏水端會自發性聚集而形成微脂粒。若與DNA混合,則其疏水端可將DNA包覆起來,而將親水端暴露在外。由於細胞膜主要成分亦是磷脂質,因此磷脂質與細胞膜接觸時可利用融合現象將DNA送入細胞。這方法已廣泛使用於DNA轉染入細胞,因此也用於基因治療,但一般而言,微脂粒傳送效率並不高。



 



06.受體引導之基因轉殖



 



若是我們希望將DNA特異性地帶入某些細胞,則可尋找這類細胞是否具有特異性的受體。透過這些受體,可使DNA進入特定細胞。但是缺點就是,DNA在胞內小體卻很容易被分解掉,導致基因轉殖的效率差。



 



07.DNA直接注射



 



直接將帶有目標基因的質粒DNA以注射或點滴送入體內,這方法非常簡便,但DNA送入細胞的效率不高。即使DNA進入細胞,裸露DNA也容易被細胞內的酵素分解,而無法進入細胞核內表現,或者表現時間短暫而須重複施打基因。但此法主要優點在副作用及潛在毒性較小。



 



.基因治療的應用



 



01.血液疾病



 



血液疾病是基因治療發展初期的首要目標。由於初期技術能力的有限,以及對於基因表現的調控並未能充分了解,對於某些複雜的疾病、多個基因缺陷所引起的疾病或是需有嚴格控制基因產物必要的疾病,都不是技術所能夠勝任的。相對的,若是只有一個基因問題的疾病,以及對基因產物的需求不需嚴格控制,只要少許的表現即可改善症狀之疾病者。單一的血細胞顯然是很好的對象。但血細胞的壽命有限。因此,被矯正的細胞會慢慢消失,需要長期的進行反覆治療。進一步的研究看來最有可能的「靶」,將是骨髓的幹細胞。幹細胞會生成各式各樣的血球細胞,若能將好的基因直接轉殖到造血幹細胞,將可治療無數種與血液有關的疾病。而且,它們的壽命與病人的壽命一樣長。因此,將基因轉殖至該等細胞,將是終生性質的治療。但現存的困難是:血液中幹細胞比例本來就非常少,其分裂時間又很短,大部分均屬不分裂時期,利用反轉錄病毒載體所攜入的基因,很難擊中目標。更遑論誘導這些幹細胞在體內產生很多新的血細胞。



 



02.肝肺疾病



 



不少疾病與肝細胞內的代謝有關,但肝組織柔軟,體外培養亦不是很容易,進行肝細胞的基因轉殖,是一件很難的任務。目前主要有兩種方式:一是從病人體內取走帶有毛病的基因的細胞,在將其送回體內之前,給予受影響的DNA正常的拷貝。利用反轉錄病毒,再重新由肝靜脈打回,使其回肝臟。二是考慮肝細胞體外培養不易,且多數並不分裂,用腺病毒載體或微魯粒包埋DNA的方式進行基因轉殖。其轉殖效率固然比反轉錄病毒載體高出許多,但都明顯地遇到另一個問題,那就是非常短暫性的基因表現。如何使好的肝細胞能有持續性的基因表現、維持良好的轉殖效率,都是將來應繼續努力的方向。而肺疾病更是棘手。考慮肺組織的結構,移植回去近乎不可能,而且絕大多數肺表皮細胞並不分裂,一法可說是完全不可行。唯有利用腺病毒載體或微魯粒的方式,才可以有效地將基因送到呼吸道上之表皮細胞而達到療效。目前所碰到的問題就是如何克服免疫反應而可重覆的使用腺病毒載體來進行基因治療。



 



03.感染性疾病



 



關於感染性疾病研究最多的,應是針對AIDS的治療。雖然許多方法仍止於研究階段,實際進入臨床的並不多。目前主要有三種叫可靠的方法:(1)
RNA誘捕法(2) Transdominant(TD)蛋白質(3)反譯RNA。



(1) RNA誘捕法:HIV的基因表現,常需有一些特殊的小蛋白質來剌激,方得以大量產生,例如rev。rev的作用是必須由其結合到一個特定的序列,RRE,始可作用。RNA誘捕法就利用基因轉殖方式,引入RRE的序列,在細胞內大量表現,吸引走rev蛋白質,使其不再結合到HIV上之RRE的位置,因而導致HIV的表現下降。



(2)
Transdominant(TD)蛋白質:既然可以增加RRE,那為何不能增加rev呢?這個方法就是展一些rev的變異種,它仍保有結合RRE位置的特性,卻失去了功能。故若將此TD
mutant利用基因轉殖,於細胞內大量表現,則它會競爭HIV上這些結合位置,因而造成HIV的表現降低。



(3)反譯RNA:基因轉錄後,首先形成單股RNA,此時可導入與其序列互補的反義RNA使二者結合,因此後續的轉譯過程便被阻止,而使蛋白質的合成無法繼續進行,因而可以抑制HIV的基因表現。



 



04.心臟血管疾病



 



動脈血管壁上其實是一種多細胞所組成的結構,血管之平滑肌細胞一般是不分裂的,它們控制著血流量血壓,血液凝固栓塞等的問題。在某些情況下,血管壁細胞創傷,而使SMC開始分裂增生。進而影響血管變細產生動脈硬化、血壓升高等之心臟血管疾病。目前有人利用自殺基因,如HSV-tk來消除這些增生的細胞,或利用NO合成酵素來控制血管細胞的分裂。這些方法都提供了對心血管疾病有進一層控制作用。除此之外,血管栓塞等疾病可以載體送入VEGF的基因來促進血管增生以治療。



 



05.癌症腫瘤



 



癌症的形成則往往與致癌基因過度表現以致正常細胞過度生長或轉化,或抑癌基因如p53未表現以致癌細胞過度繁殖有關。關於前者,是將一自殺基因特別的引入腫瘤細胞內,而不到正常的細胞內,然後再處以特殊藥物,它將會導致帶有自殺基因的腫瘤細胞的死亡。最典型的例子就是一些皰疹病毒之tk基因。tk酵素會將一些核霉酸之類似物進行磷酸化,導致這類產物最後會被用以合成DNA,而造成DNA複製的終止,細胞於是死亡。對於後者則可利用基因載體,將抑癌基因送入癌細胞以抑制腫瘤擴散。



 



●結論



 



人類基因計畫的進行,已讓我們對更多疾病的成因有更多了解,對許多原本無解的疾病,也出現了解決的曙光。雖然基因治療仍然有許多問題存在,諸如反轉錄病毒載體之太低的力價、作的複雜性、只對分裂細胞有感染的能力。腺病毒載體之短暫性表現、免疫反應的產生。以及如何將治療基因正確送入目標細胞等等問題。除此之外,討論基因療法的前景和問題,如果不論及安全和倫理上的影響,那是不完整的。



安全上,<治療基因是否會被嵌入其他重要基因位置而導致副作用>,一直是一個很嚴重的問題。法國費雪的團隊針對嚴重複合性免疫缺陷症進行的基因治療,在11名病童中治癒了9名,這些結果讓人對基因治療產生無限的期待。但在療程結束後二年半,卻發現一名病童白血球大量增生,經分析發現有些病毒將攜帶的基因插入11號染色體上一個叫做LMO2的基因上,LMO2被破壞時會導致無法控制的細胞分裂和癌症。經過多次嘗試,費雪等人已相信接受這種攜帶基因的病毒治療的男童大多會出現同樣問題。另外,一九九八年在賓州大學所進行的臨床實驗,以腺病毒為基因載體也曾造成一名少年死亡。



 



道德上的問題就更大了。基因治療目前僅能以體細胞為對象,而嚴禁生殖細胞。因為前者不論結果如何,受影響的只有當事人本身,如果擴大範圍,使生殖細胞改變,影響後代具有不同的遺傳基因。這種基因治療引起道德的爭議。進一步,基因治療還可分為兩種表現,一是改變有缺陷的基因,一是增強現有的基因,使下一代有更好的基因,發揮更優越的成就。前者由於是一種基因疾病,一般會得到認可。後者則並不是病,而且其後果就相當嚴重。



為此,我們必須認識到基因療法有好有壞,才能說我們跨入令人興奮的新時代。正如我們在基因療法方面所得到好處那樣,我們必須記住基因療法潛在的危險,並時時刻刻保持警惕。當然,就光明的一面來說:希望有一天,基因治療,可以針對許多目前無解的病症提供另一線的曙光。



 



●引註資料



01. www.bioteach.ttu.edu.tw/bioterm/genetherapy.htm



張效明/大同大學生物工程研究所



02. www.sinica.edu.tw/~hispj/program/abstract/re22.pdf



    基因治療/徐松錕/中央研究院 生物醫學科學研究所



03. www.ncu.edu.tw/~phi/teachers/lee_shui_chuen/course_onnet/gene.html
基因疾病、基因治療與醫療保健/李瑞全/中央大學哲學研究所



04.http://www.nsc.gov.tw/popular_science.asp?add_year=2003&popsc_aid=324
科普知識



05. 生物學上冊 Nei A Campbell原著
偉明圖書股份有限公司出版



06. 牛頓雜誌 211期



07. DNA的14堂課 Karl Drlica
原著 天下文化出版



 

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Julia Chen

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